一种用于诊断虾过敏患者的微针贴片及其制备方法与应用

本发明涉及免疫分析过敏性疾病诊断，特别涉及一种用于诊断虾过敏患者的微针贴片及其制备方法与应用。

背景技术：

1、随着人们消费水平的提升和饮食结构的改变，虾在日常饮食中的占比越来越高，随之而来的健康问题的也源源不断，其中虾类过敏是影响范围广、占比高、危害严重的主要健康问题。当虾过敏患者接触到虾类食品(含有虾类成分)，均可能产生过敏反应，这些反应包括呼吸道(哮喘等)、消化道(肠炎等)、皮肤(荨麻疹等)等症状，最严重的可能危及生命。因此开发过敏诊断技术，使过敏患者明确自身过敏原，避开过敏食物，能够有效避免过敏反应的发生。

2、现有诊断技术可以分为体内诊断技术(人体上进行)和体外诊断技术(采集血液等)两大类。体内诊断技术包括食物激发实验、皮肤点刺实验、斑贴试验等，体外诊断技术主要是指immunocap。体内诊断的优点是简单、经济、准确，缺点是由于患者与潜在过敏原直接接触，可能导致局部或者全身不良反应，体外诊断方法的优点是安全、准确，缺点是耗时、检测费用高。此外，现有的诊断方法一般需要专业的操作人员。

3、为了解决现有诊断方法安全性低、耗时、需要专业操作人员的问题，填补过敏原居家快速初筛方面的空白，有必要开发一种用于虾过敏患者现场、快速、便捷诊断的微针贴片制备方法。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于诊断虾过敏患者的微针贴片的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的用于诊断虾过敏患者的微针贴片。

3、本发明的再一目的在于提供所述用于诊断虾过敏患者的微针贴片的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种用于诊断虾过敏患者的微针贴片的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)制备ⅰ型特异性生物墨水

7、将10，12-二十五碳二炔酸(pcda)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dmpc)分别溶解到氯仿中，得到pcda溶液和dmpc溶液；然后将pcda溶液和dmpc溶液混合均匀后经干燥得到pcda/dmpc薄膜；接着加水重悬，于80±5℃条件下辅以超声、磁力搅拌混合均匀，得到pcda/dmpc浊液；再将pcda/dmpc浊液静置后过滤，得到pcda/dmpc囊泡；将pcda/dmpc囊泡与hrp标记的抗人ige抗体混合，过夜孵育反应后再加入牛血清白蛋白(bsa)，经紫外灯照射诱发交联，得到ⅰ型特异性生物墨水；

8、(2)制备ⅱ型特异性生物墨水

9、将mes缓冲液采用等离子设备处理制成等离子体活性水，然后依次加入10，12-二十五碳二炔酸(pcda)、碳二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和虾过敏原对应的表位，震荡混合均匀，经液相色谱去除杂质，得到表位-pcda；接着将表位-pcda与1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dmpc)分别溶解到氯仿中，得到表位-pcda溶液和dmpc溶液；再将表位-pcda溶液和dmpc溶液混合均匀后经干燥得到表位-pcda/dmpc薄膜；加水重悬，于60±5℃条件下辅以超声、磁力搅拌混合均匀，得到表位-pcda/dmpc浊液；静置、过滤，得到表位-pcda/dmpc囊泡；最后加入牛血清白蛋白(bsa)，经紫外灯照射诱发交联，得到ⅱ型特异性生物墨水；

10、(3)制备微针贴片

11、将裁切的吸水纸分别浸没在步骤(1)中得到的ⅰ型特异性生物墨水和步骤(2)中得到的ⅱ型特异性生物墨水中，随后取出，自然风干，得到风干后的吸水纸ⅰ和ⅱ；将甲基丙烯酸明胶(gelma)填充在微针模具底部，真空除气泡，经等离子体处理催化交联，自然风干，再将风干后的吸水纸ⅰ和ⅱ同时填入微针模具中，重复此操作(填充gelma、真空除气泡、等离子体处理催化和自然风干操作)至模具凹槽完全覆盖；待自然风干后脱模，得到用于诊断虾过敏患者的微针贴片。

12、步骤(1)中所述的10，12-二十五碳二炔酸(pcda)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dmpc)的摩尔比为3～4：1；优选为4:1。

13、步骤(1)中所述的pcda溶液的浓度优选为10mmol/l。

14、步骤(1)中所述的dmpc溶液的浓度优选为10mmol/l。

15、步骤(1)和(2)中所述的干燥为真空干燥。

16、步骤(1)和(2)中所述的水为超纯水。

17、步骤(1)中所述的pcda/dmpc浊液中的pcda的浓度为3～4mmol/l；优选为4mmol/l。

18、步骤(1)和(2)中所述的超声的条件为：超声功率为130～150w(优选为140w)，采用间歇处理，一个超声周期为10s超声开，10s超声关。

19、步骤(1)和(2)中所述的搅拌的转速为100～140r/min；优选为120r/min。

20、步骤(1)和(2)中，辅以超声、磁力搅拌混合均匀的总处理时间为40～50min；优选为50min。

21、步骤(1)和(2)中所述的静置的时间为8～12h；优选为12h；

22、步骤(1)和(2)中所述的过滤为采用0.22μm的滤膜进行过滤。

23、步骤(1)中所述的hrp(辣根过氧化物酶)标记的抗人ige抗体的用量为按其在反应体系的终浓度为1～1.5μg/ml添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为1μg/ml添加计算。

24、步骤(1)和(2)中所述的牛血清白蛋白(bsa)的用量为按其在反应体系的终浓度为质量百分比0.1％添加计算。

25、步骤(1)和(2)中所述的紫外灯照射的条件为：紫外强度为500mw/cm2，紫外处理时间3～5min。

26、步骤(2)中所述的mes缓冲液为ph 6.7的mes缓冲液。

27、步骤(2)中所述的等离子设备可采用本领域常规的等离子放电实验装置进行，如大气低温等离子放电实验装置(南京苏曼等离子科技有限公司，型号dbd-50)等。

28、步骤(2)中所述的制成等离子体活性水的条件为：在电压50v、电流1ma、极板间距13mm的条件下处理1min。

29、步骤(2)中所述的10，12-二十五碳二炔酸(pcda)的用量为按其在反应体系的终浓度为8～10mmol/l添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为10mmol/l添加计算。

30、步骤(2)中所述的碳二亚胺(edc)的用量为按其在反应体系的终浓度为45～50mmol/l添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为50mmol/l添加计算。

31、步骤(2)中所述的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的用量为按其在反应体系的终浓度为45～50mmol/l添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为50mmol/l添加计算。

32、步骤(2)中所述的虾过敏原表位的用量为按其在反应体系的终浓度为3～5mg/ml添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为4mg/ml添加计算。

33、步骤(2)中所述的虾过敏原表位的氨基酸序列为：lenrslsdeermdalenq、drledelvnekekyksitde、laeeadrkydevark、amklekdnamdra，四条表位序列的摩尔比1:1:1:1。

34、步骤(2)中所述的表位-pcda溶液的浓度优选为10mmol/l。

35、步骤(2)中所述的dmpc溶液的浓度优选为10mmol/l。

36、步骤(2)中所述的表位-pcda与1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dmpc)的摩尔比为3～4:1；优选3:1。

37、步骤(2)中所述的表位-pcda/dmpc浊液的表位-pcda的浓度为5～6mmol/l；优选为6mmol/l。

38、步骤(3)中所述的吸水纸为超薄吸水纸，其尺寸可以根据实际需要进行裁剪，优选为：长2.5mm，宽2.5mm，厚度0.2mm。

39、步骤(3)中所述的浸没时间为5～10min；优选为10min。

40、步骤(3)中所述的微针模具为pdms模具，其大小形状可以根据实际需要进行设置；所述的pdms模具优选为凹槽基底部分为立方体、针尖部分为圆柱体的模具，其凹槽基底部分的尺寸为：长10mm，宽10mm，高1.5mm；微针针尖部分的尺寸为：针长0.8～1mm，针尖直径0.01～0.02mm，底面直径0.25～0.35mm，针尖距离0.5～0.7mm，阵列数量为(9*9)～(11*11)；微针针尖部分的尺寸优选为：针长0.8mm，针尖直径0.015mm，底面直径0.3mm，针尖距离0.6mm，阵列数量为11*11。

41、步骤(3)中所述的甲基丙烯酸明胶(gelma)的浓度为质量百分比18～22％；优选为质量百分比20％。

42、步骤(3)中所述的重复的次数为5次，即甲基丙烯酸明胶(gelma)的每次填充量为100μl，一共填充600μl。

43、步骤(3)中所述的真空除气泡的条件为：0.1mpa，处理3～5min(优选为5min)。

44、步骤(3)中所述的等离子体处理的条件为电压160～169kv，电流150～200ma，极板距离2.5～3cm，处理5～10min；优选为：电压169kv，电流200ma，极板距离2.5cm，处理5min。

45、一种用于诊断虾过敏患者的微针贴片，通过上述任一项所述的得到制备得到。

46、所述的用于诊断虾过敏患者的微针贴片在制备诊断虾过敏患者的试剂盒中的应用。

47、所述的试剂盒的使用方法如下：

48、(a)待测样本提取：

49、将上述微针贴片直接贴于待测人员的皮肤表面，或先提取待测人员的血清配制成gelma凝胶，然后将上述微针贴片刺入gelma凝胶的表面，等待10～15分钟(优选为10分钟)；

50、(b)结果判断：

51、如果过敏标志物总ige和sige区域均不发生变色(蓝色)，则判定为该待测人员属于低过敏风险人群；如果过敏标志物总ige和sige区域由蓝色变为红色，则判定为该待测人员对虾具有高过敏风险；如果过敏标志物总ige区域由蓝色变为红色，sige区域不发生变色(蓝色)，则判定为该待测人员具有其他过敏风险；如果过敏标志物总ige区域不发生变色(蓝色)，sige区域由蓝色变为红色，属于无效结果，需要重新检测。

52、步骤(a)中所述的gelma凝胶通过如下方法制备得到：将含有光引发剂的甲基丙烯酸明胶(gelma)填充在24孔板中进行紫外交联处理，常温放置10～14h(优选为12h)后，放入-80±5℃冷冻2h，再在-65±5℃条件下冷冻干燥，得到冻干后的gelma；再将血清加入到冻干后的gelma中，混合均匀，常温放置1～3h(优选为2h)后，放入4℃冰箱，即得。

53、所述的含有光引发剂的甲基丙烯酸明胶中的光引发剂的含量为质量百分比0.5％。

54、所述的甲基丙烯酸明胶(gelma)的浓度为质量百分比18～22％；优选为质量百分比20％。

55、所述的光引发剂为光引发剂2959。

56、所述的紫外处理交联的条件为：紫外强度为500mw/cm2，紫外处理时间3～5min(优选为5min)。

57、所述的冷冻干燥的时间优选为48h以上。

58、步骤(a)中所述的其他过敏包括牛奶过敏等。

59、本发明中的诊断微针贴片的诊断原理如下：

60、(i)待测样本提取：将微针贴片贴于待测人员的皮肤表面，当微针刺入皮肤后，皮下组织液在微针的溶胀吸附作用下发生富集；

61、(ii)特异性标志物识别：富集后的组织液与固定在微针中含有可视化探针的吸水纸接触，组织液中含有的过敏标志物(总ige、sige)与可视化探针发生特异性结合，导致探针结构发生改变，引发变色反应；

62、(iii)结果判断：通过不同位置信号分子的颜色变化情况，可以判断是否存在食物过敏风险。

63、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

64、(1)本发明方法将微针技术与可视化信号探针相结合，结合了微针微创、无痛和信号分子可视化的优点，以过敏标志物sige和总ige为检测对象，通过sige和总ige与信号探针特异性结合变色的现象，实现食物过敏的定性诊断。

65、(2)本发明以等离子体活性水作为edc-nhs偶联的缓冲体系，为活化提供了丰富的电子转移路径，提高了活化效率。

66、(3)本发明以等离子体替代传统光引发剂、紫外促使gelma发生交联，绿色、环保、高效。

67、(4)本发明可以利用皮肤间质液，实现对虾过敏患者的现场、快速、便捷诊断，且可以通过更换ⅱ型特异性生物墨水的制备过程中表位的种类，可以实现虾过敏之外的其他食物过敏类型诊断，具有拓展至其他过敏性疾病诊断的潜力，应用前景广泛。