一种基于比率策略的长棘海星生物传感器的设计方法

本发明涉及生物传感器设计，尤其涉及一种基于比率策略的长棘海星生物传感器的设计方法。

背景技术：

1、近几十年来，珊瑚白化现象日益严重。其中长棘海星的周期性暴发是造成珊瑚白化和死亡的主要原因之一，其暴发密度可高达每公顷1000多只，对珊瑚造成严重破坏。自1960年代以来，澳大利亚大堡礁(gbr)经历了四次大规模的长棘海星暴发，而我国南海珊瑚礁也屡次受到了长棘海星的破坏，导致珊瑚覆盖率下降和珊瑚礁生态功能退化。因此，对长棘海星开展有效的监测工作，有助于及时发现长棘海星的暴发，从而采取干预措施，阻止长棘海星进一步破坏珊瑚。目前对长棘海星的常规监测主要是利用蝙蝠拖曳技术(mantatow)进行调查，与标准样带技术相比，蝙蝠拖曳技术具有更广的调查覆盖范围(～2400m2)，并且该技术已成功用于监测大堡礁长棘海星的密度变化。但长棘海星的高隐蔽性特点，导致该方法仅检测到5-10％的个体，阻碍了对长棘海星暴发的早期发现。

2、环境dna(environmental dna，edna)技术具有简单高效、无创和对目标物种特殊指征的优点，在水生环境中已被广泛应用。uthicke等[1]利用ddpcr技术检测gbr地区长棘海星edna浓度变化，实现了对该地区长棘海星的有效监测。该研究证明了利用edna技术监测长棘海星的可行性。

3、但ddpcr技术的反应条件较为苛刻，需要在高温、精确的热循环系统下进行。这使其仅在实验室条件下表现出对edna的出色检测能力。同时将edna从现场运回实验室需要较长的运输时间，容易导致edna发生降解，并增加了运输成本。因此，亟需开发一种简单高效且能快速检测edna的技术。

4、基于单信号模式的电化学dna传感器，存在无法区分靶标结合和电极劣化所引起的信号变化问题。这种不确定性可能会影响传感器的准确性、稳定性和重现性，从而限制了其在实际应用中的广泛使用。本发明，利用双信号策略有效提高传感器的准确性，同时利用电化学dna传感器检测速度快、设备微型化、无线化可实现现场检测的优点，开发了一种比率电化学dna传感器用于快速检测长棘海星edna。该技术与传统调查技术相比，节省了大量人力物力，并且避免受复杂海况影响威胁潜水员人身安全问题，提高了调查结果的准确度和监测效率，为长棘海星监测工作提供一种新思路。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于比率策略的长棘海星生物传感器的设计方法，解决现有电化学dna传感器准确性低，还无法应用于海洋生物dna检测的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种基于比率策略的长棘海星生物传感器的设计方法，所述方法包括如下步骤：

4、步骤1：设计dna探针；

5、步骤2：比率电化学dna传感器的构建及电化学测试；

6、步骤3：比率电化学dna传感器原理分析；

7、步骤4：对比率电化学dna传感器构建进行验证；

8、步骤5：比率电化学dna传感器的性能测试。

9、进一步地，步骤1中，dna探针的捕获探针的序列为：fc-cgaccatcttttttttttttttttcattctgatggtcg-(ch2)6-sh，信号探针序列为：mb-aaaaaaagaatgaaaaaacttgttcattcgggggaaggc，目标序列为：gccttcccccgaatgaacaacatgag，正向引物的序列为：tcactcctccaagacgacca，反向引物的序列为：gcaaggtccactgatcctcc。

10、进一步地，步骤2的具体过程为：

11、传感器构建前，对金电极ge进行预处理以获得均匀的电极表面，首先ge依次用1、0.3、0.05μm的al2o3粉末对电极进行抛光打磨，然后分别在乙醇和去离子水中超声5min，随后在0.5m h2so4溶液中使用循环伏安法对ge进行电化学表面清洁，以100mv/s的扫描速率，在-0.35v-1.5v的vs.ag/agcl的电位窗口进行30次循环扫描以去除电极表面的杂质；

12、将捕获探针cp稀释在34mm tris-hcl中，然后加热至95℃保持5min，自然冷却20min恢复至室温，使cp形成发夹结构，加入10mm tcep，在室温下避光处理60min进行s-s切割，放置4℃冰箱保存备用，将10μl准备好的cp溶液滴加在干净的电极表面，盖上塑料帽减少蒸发，然后放置4℃下孵育过夜，标记为cp/ge，加入10μl的1mm 6-巯基-1-己醇到cp/ge表面孵育45min，阻断非特异性位点并获得排列良好的dna分子层，标记为mch/cp/ge；

13、在干净的离心管中进行exoш辅助信号放大反应，具体操作如下，在66mm tris-hcl缓冲溶液中加入1000nm的信号探针和各种浓度的目标dna(进行充分混合，然后加入exoш并在37℃孵育2h，随后加热至75℃保持10min使exoш灭活，最终得到信号扩增反应液，信号扩增反应液中含有大量被酶切后保留mb标记的片段dna，滴加10μl信号扩增反应液到mch/cp/ge表面，进行杂交2h，记为residual dna/mch/cp/ge，用pbs冲洗三次，进行电化学测试；

14、进行电化学测试，其中三电极系统包括金电极ge工作电极、ag/agcl参比电极和pt对电极，循环伏安法和电化学阻抗谱在5mm[fe(cn)6]3-/4-/0.1mkcl中进行电化学测试，用于验证ge的修饰过程，差分脉冲伏安法测试在pbs中进行，cv测试是在0v-0.5v的电位范围和100mv/s的扫描速率下进行，eis测量的频率范围设定为0.1hz-100khz，dpv测量在-0.4v-0.55v的电位范围内进行，步长为5mv，脉冲高度为50mv，脉冲宽度为500ms。

15、进一步地，步骤3的具体过程为：

16、在cp的3'端修饰上巯基-sh，通过-sh和金电极之间形成au-s键的方式将cp固定在电极表面，在cp的5'端修饰有fc基团作为内参信号，若干对碱基对使cp的茎部保持稳定状态，在电化学测试过程中fc的电化学信号保持稳定，另一方面，在sp的5'端修饰mb基团，同样若干对碱基对使sp保持闭合状态，并且有突出的3'端，保护sp在无目标dna存在的情况下不被exoⅲ切割，当sp与长棘海星dna结合后，sp从闭合状态转换成打开状态，exoⅲ开始对sp从3'到5'方向进行酶切，酶切完成后，目标dna被释放出来参与到下一次循环反应，经过若干次酶切循环反应后产生含有mb的dna片段，dna片段与cp通过碱基互补配对的方式结合到电极表面，在电位窗口同时测得fc和mb的电化学信号，mb的信号强度与目标dna浓度成正比，而fc作为内参信号用来校正电极在修饰过程中产生的误差和检查电极修饰过程中是否被污染，提高传感器检测的准确性，最后以imb/ifc的比值对目标dna进行定量计算。

17、进一步地，步骤4的具体过程为：

18、进行有效表征传感器逐步构建得到阻抗谱图，谱图中半圆直径与界面的电荷转移电阻有关，ge表现出比设定值小的电荷转移电阻，表明电极表面清洁干净，当cp固定在ge表面时，rct值增大，由于cp磷酸基团带有的负电荷增加了与[fe(cn)6]3-/4-阴离子的静电斥力，导致电子转移速率下降，加入mch封闭电极表面多余的活性位点后，rct值再次增大因为mch具有较差导电性，加入mch后导致电极表面的电荷转移速率降低，最后，加入信号扩增反应液，随着带有mb标记的dna片段与cp杂交后，电极表面带正电荷的mb密度增加，与磷酸基团的负电荷产生电荷中和效应，减小磷酸基团的负电荷与[fe(cn)6]3-/4-离子之间的静电斥力，加快电极表面的电子转移速率，使得rct值减小；

19、进行cv测试，氧化还原峰电流以及电位的分离用于表征电极的不同修饰，对于ge观察到一对[fe(cn)6]3-/4-氧化还原峰，表明ge表面的电子转移速率比设定值快，由于cp的磷酸基团带有负电荷与[fe(cn)6]3-/4-产生静电排斥作用，阻碍电极表面的电荷转移，cp固定在ge上会导致峰值电流降低，当cp/ge上的活性位点被mch阻断时，峰值电流进一步降低，并且峰值电位的分离变大，信号扩增反应液加入传感平台后，由于被酶切后的dna片段仍标记有mb，mb的正电荷减小电极表面对[fe(cn)6]3-/4-的斥力，与mch/cp/ge相比较，峰值电流增大，cv的结果与eis测试结果相一致，表明比率电化学dna传感器已被成功制备。

20、进一步地，步骤5的具体过程为：

21、灵敏度测试，在最佳实验条件下利用dpv电流信号输出的方式，最佳实验条件为mch浓度为1mm且封闭时间为40min，cp 400nm，sp 1000nm，以10倍浓度阶梯对靶标长棘海星dna定量检测，imb随着靶dna浓度的增加而不断增加；

22、在300fm至10nm范围内，imb/ifc值与靶dna浓度对数值之间呈现良好的线性关系，并且该线性关系如公式(1)所示：

23、imr/ifc＝0.12704x+0.2577，r2＝0.997        (1)

24、其中，imb/ifc是双信号的比率，x是目标dna浓度的对数。

25、imb/ifc＝s0+3σ              (2)

26、其中，s0是空白样品测得imb/ifc的平均值，σ是空白样品imb/ifc平均值的标准偏差；

27、imb/ifc＝s0+10σ          (3)

28、其中，s0是空白样品测得imb/ifc的平均值，σ是空白样品imb/ifc平均值的标准偏差；

29、lod根据公式(2)计算，得到lod等于93fm，loq根据公式(3)计算，得到loq等于245fm，在最佳测试条件下，获得出色的灵敏度，因为exoⅲ的加入允许目标dna循环反应，产生大量带有mb标记的dna片段与电极表面的cp杂交，测得稳定的电化学信号；

30、重现性、稳定性和特异性测试，分别用平行的五根电极测试10pm目标dna，五根平行电极的电化学测试结果，rsd为2.05％，表明传感器具有重现性，确保传感器测试的准确性和稳定性；

31、将制备好的传感器储存在4℃下，对稳定性进行监测，在第9天时仍能保持初始值的90.9％，表明传感器在合适的储存条件下具有稳定性；

32、利用传感器分别检测长棘海星、粒皮瘤海星、鹿角杯形珊瑚、胡麻斑蝴蝶鱼、空白样品和所有物种dna的混合样品，其中长棘海星、粒皮瘤海星、鹿角杯形珊瑚、胡麻斑蝴蝶鱼是珊瑚礁中常见物种，被选作为干扰物种，比率电化学dna生物传感器对干扰物种dna的响应电流接近空白样品的响应电流，传感器对长棘海星dna的检测具更明显的电流信号，同时混合样品也测得相近的结果，生物传感器对长棘海星dna的检测具有特异性，对干扰物种具有很好抗干扰能力，比率电化学dna生物传感器能够在复杂的样品条件下准确识别长棘海星dna。

33、本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

34、本发明将exoⅲ辅助目标循环放大技术与双信号比率策略有效结合，提高了传感器的灵敏度和准确性。经过优化测试条件后，比率电化学dna生物传感器表现出良好的电化学性能，线性检测范围为300fm-10nm和较低的检测限(lod 93fm)。在实际样品分析中，本发明构建的比率电化学dna传感器成功检测到样品中的长棘海星edna，与现场生态调查结果相一致，证明了该传感器对长棘海星edna的实时动态检测具有巨大的潜力。