一种多棱柱结构的夹心型光寻址免疫传感阵列的制备方法及应用

本发明属于光电化学传感器领域，涉及一种多棱柱结构的夹心型光寻址免疫传感阵列的制备方法及应用。

背景技术：

1、ad是迄今为止最常见的痴呆病，约占所有痴呆诊断的80%，每年与ad有关的直接和间接保养费用巨大，给世界公共卫生体系和养老体系带来不容小觑的挑战。由于ad患者在早期阶段症状不明显，但已经出现了病理变化。寻找具有高灵敏度、高通量的检测方法有利于实现对ad患者的早期诊断，并及时采取治疗措施，降低检测成本，减少治疗费用。ad发病原因复杂，通常是因为脑内β-淀粉样蛋白（aβ）的异常沉积以及磷酸化tau蛋白形成神经纤维缠结。因此，aβ和tau可作为ad特异性生物标志物。实现对aβ和tau的高通量、高灵敏检测对ad的预防和早期诊断有重要意义。

2、神经退行性疾病的诊断和监测方法有很多，例如：脑脊液分析、遗传测试、血液测试等。应当注意的是，这些测定技术受到许多因素的影响，具有灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐，检测成本高等缺点。而光电化学生物传感器融合了电化学与光电化学的双重优势，相较于其它检测方法具有高灵敏度、快速响应、操作简单、成本低廉等优点，但是也存在批间差异较大、检测通量较低、检测物单一等局限性。为了克服以上光电化学生物传感器的缺点，本发明利用设计了一种批间差异小，检测通量高，可以同时检测aβ和tau的光电化学生物传感器阵列。

技术实现思路

1、本发明的目的在于避免传统检测方法的灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐，检测成本高等缺点，提供了一种具有高灵敏度、快速响应、操作简单、成本低廉、批间差异小、检测通量高，并且可以同时检测aβ和tau的多棱柱结构的夹心型光寻址免疫传感阵列的制备方法及应用。

2、1.一种多棱柱结构的夹心型光寻址免疫传感阵列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、一、多棱柱结构zn/zno片的制备；

4、二、在多棱柱结构zn/zno片上固定cdse；

5、三、夹心型光寻址免疫传感阵列的制备；

6、其中，步骤一制备多棱柱结构zn/zno片的具体步骤为：

7、（1）先后用1500目和2000目砂纸对纯度为99.99%的锌箔进行抛光打磨，将抛光后的锌箔等比例折叠成三到八棱的棱柱结构，分别在乙醇和去离子水中超声清洗10 ~ 20min，然后用氮气吹干；

8、（2）配制35 ~ 70 ml 0.3 ~ 0.6 mol/l nh3·h2o和0.06 ~ 0.12 mol/l naoh的水溶液，超声10 ~ 20 min，将该溶液和步骤（1）中清洗后的多棱柱结构转移至50 ~ 100 ml聚四氟内衬高压反应釜中，在100 ℃下加热反应44 ~ 48 h，自然冷却至室温后，获得多棱柱结构zn/zno片，将其从溶液中取出，用去离子水和乙醇冲洗，在60 ℃下真空干燥；

9、其中，步骤二在多棱柱结构zn/zno片上固定cdse的具体步骤为：

10、（1）配制35 ~ 70 ml的0.2 mol/l na2so3、0.1 mol/l se和0.05 mol/l naoh的水溶液，超声1 ~1.5 h，将上述溶液缓慢转移至50 ~ 100 ml聚四氟内衬高压反应釜中，在70℃下加热反应6 ~ 8 h，得到改性的na2seso3溶液，然后将改性后的na2seso3溶液用0.22 μm滤网注射器过滤，60 ℃下避光保存；

11、（2）在棕色磨砂玻璃塞烧瓶中加入30 ~ 60 ml超纯水和7 ~ 14 ml在步骤（1）中得到的改性的na2seso3溶液，超声10 ~ 20 min，再加入0.02 ~ 0.04 mol/l cd(ch3coo)2·2h2o，超声10 ~ 20 min，继续加入0.6 mol/l nh3 h2o，超声10 ~ 20 min，将上述溶液转移至100 ~ 150 ml聚四氟内衬高压反应釜中，并将在步骤一中得到的多棱柱结构zn/zno片缓慢浸入到该溶液中，在90 ℃下加热反应1 ~ 1.5 h，反应结束后，将产物从混合溶液中取出，分别用去离子水和乙醇彻底冲洗，在60 ℃下真空干燥，制得多棱柱结构zn/zno/cdse片；

12、其中，步骤三夹心型光寻址免疫传感阵列的制备具体步骤为：

13、（1）将2 ~ 4 mmol zncl2·6h2o和4 ~ 8 mmol fecl3·6h2o溶于30 ~ 60 ml乙二醇中，然后缓慢加入30 ~ 70 mmol醋酸钠，超声1 ~1.5 h，将上述溶液中缓慢转移至50 ~100 ml聚四氟内衬高压反应釜中，在180 ℃下加热反应17 ~ 20 h，将所得产物用乙醇和超纯水各离心洗涤3次，60 ℃下真空干燥12 h，最后将干燥后的产物在管式炉中于500 ℃氩气环境下反应2小时，得到znfe2o4纳米球；

14、（2）将5 ~ 10 mg znfe2o4纳米球溶解在5 ~ 10 ml 1 mol/l酒石酸钠溶液中，在80℃下油浴10 ~ 12 h，离心洗涤重新分散到5 ~ 10 ml超纯水中，然后向上述溶液中加入8 ~16 ml 的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺，震荡活化1 ~ 2h，活化结束后离心洗涤重新分散到5 ~ 10 ml pbs缓冲溶液中，继续向上述溶液中加入1 ~2 ml二抗ab2(10 μg·ml-1) ，在4 ℃下震荡孵育1 ~ 2 h，孵育结束后离心并用pbs缓冲溶液洗涤，重新分散5 ~ 10 ml pbs缓冲溶液中，最后向上述溶液中加入1 ~ 2 ml的1％的牛血清蛋白pbs缓冲溶液，4 ℃下震荡孵育1 ~ 2 h，封闭非特异性结合位点，孵育结束后离心洗涤并分散至5 ~ 10 ml pbs缓冲溶液中，得到znfe2o4-ab2溶液；所述二抗可以是β淀粉样蛋白aβ或微管相关蛋白tau的第二抗体；

15、（3）在步骤二中得到的多棱柱结构zn/zno/cdse片各个侧面各粘贴1 ~ 20张边长2~ 5 mm正方形且中心有直径1 ~ 4 mm圆形镂空的绝缘贴纸，将该工作电极各个侧面都划分为1 ~ 20个相同大小的圆形点位；

16、（4）在上述各个点位上分别修饰3 ~ 4 µl、0.1 mol/l的巯基乙酸，室温下晾干，继续滴加3 ~ 4 μl的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺，反应20~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

17、（5）在步骤（4）中得到的电极表面点位修饰4 ~ 5 µl、8 ~ 10 µg/ml的一抗ab1，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；所述一抗可以是aβ或tau的第一抗体；

18、（6）在步骤（5）中得到的电极表面点位上均修饰4 ~ 5 µl的1 ~ 1.5 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

19、（7）在步骤（6）中得到的电极表面点位上修饰4 ~ 5 µl的抗原或样品溶液，反应20~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

20、（8）在步骤（7）中得到的电极表面点位上修饰4 ~ 5 µl步骤（2）制得的znfe2o4-ab2，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得夹心型光寻址免疫传感阵列。

21、2. 所制备的多棱柱结构的夹心型光寻址免疫传感阵列，其特征在于，用于aβ和tau检测，应用步骤如下：

22、（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度aβ抗原和tau抗原的标准溶液；

23、（2）工作电极修饰：将空白标样和不同浓度的aβ和tau抗原标准溶液应用于技术方案1步骤三（7）中，其它保持不变，作为工作电极；

24、（3）工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极体系，在电解质溶液中进行测试；采用i-t曲线对分析物进行检测，设置电压为0 v，运行时间100 s，激发光源为led灯；检测对不同浓度的aβ抗原标准溶液和不同浓度的tau抗原标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；滴有空白标样的校准区域的光电流强度记为 i0，含有不同浓度的aβ抗原标准溶液的光电流强度记为 ia，令 i1＝ ia-  i0， i1与aβ抗原标准溶液 c1的对数之间成线性关系，绘制 i1 – lg  c1工作曲线；含有不同浓度的tau抗原标准溶液的光电流强度记为 it，令 i2＝ it-  i0， i2与tau抗原标准溶液 c2的对数之间成线性关系，绘制 i2 – lg  c2工作曲线；

25、（4）aβ和tau的检测：用待测的人体血清样品代替步骤（2）中的抗原标准溶液，其它保持不变，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应光电流强度 i1 、i2和工作曲线，得到待测样品中aβ和tau的含量。

26、（1）本发明通过旋转移动多棱柱结构的工作电极，划分多个检测点位，达到多点位连续检测的目的，降低检测成本、批间误差，提高检测效率和准确性。

27、（2）本发明直接在锌箔上原位生长zno纳米棒，用cdse来敏化zn/zno，得到光电活性显著提高的zn/zno/cdse多棱柱结构，znfe2o4作为检测抗体标记物，与zn/zno/cdse竞争消耗电子供体，放大信号，提高了传感器的灵敏度。

28、（3）本发明可以一次性同时检测复杂样品中的aβ和tau具有良好的准确性和精密度。