一种高通量代谢物检测方法及其应用与流程

本发明关于代谢物检测，尤其涉及一种高通量代谢物检测方法及其应用。

背景技术：

1、代谢组学检测生物体内各种生理代谢和循环代谢分子，便于直观分析病理生理变化。该技术为研究疾病机制和早期诊断提供了可能，将其定位为未来精准医学的核心技术。大规模代谢组学研究对分析方法提出了严格的要求，特别是在代谢物覆盖范围、定量稳定性和检测吞吐量方面。尽管基于hrms的非靶向代谢组学允许对生物样本中尽可能多的代谢物进行无偏检测，但它通常提供代谢物的相对浓度而不是绝对浓度。不同的是，基于tq-ms的靶向代谢组学强调已知代谢物的特定列表，可以使用校准曲线进一步量化，因此是获得代谢物定量数据的理想工具。然而，它的主要缺点是代谢物的覆盖范围有限。

2、拟靶向代谢组学是一种新的组学策略，结合了非靶向代谢组学和靶向代谢组学的优点：在大规模靶向代谢组学方法的开发过程中，通常使用hrms获取ms2信息(步骤1)，使用tq-ms进行高覆盖率动态mrm分析(步骤2)。基于非靶向代谢组学分析获取的ms2信息构建和鉴定mrm离子对数据集是建立大规模靶向代谢组学方法的基础。因此需要开发具有ms2覆盖范围广、鉴定可靠、重复性好等特点的创新型数据采集模式，并基于此建立高通量靶向代谢组学方法。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供一种高通量代谢物检测方法及其应用。以本发明提供的高通量代谢物检测方法能够满足精准医学研究对代谢物覆盖率广、定量稳定、检测通量大，可用于多种生物样品中代谢物的高通量检测，还可进一步用于代谢物的鉴定以及代谢途径分析。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种高通量代谢物检测方法，用液相色谱-质谱联用技术检测待测生物样品中的代谢物，所述质谱为四级杆静电场轨道阱高分辨质谱和三重四级杆质谱；所述高分辨四级杆质谱的质谱条件包括：在正、负离子模式下以非固定分段窗口间隔数据依赖采集(nfswi-dda)、非固定分段窗口间隔数据非依赖采集(nfswi-dia)或常规数据非依赖采集(dia)模式采集hrms数据，获取并注释mrm离子对；mrm列表向三重四级杆质谱过渡，所述三重四级杆质谱的质谱条件包括：在正、负离子模式下验证并检测mrm离子对。

4、本发明提供的高通量代谢物检测方法是基于创新型ms2数据采集模式建立的拟靶向代谢组方法，ms2覆盖率高、定量精密度好、ms2数据可靠、定性准确，为高通量代谢组分析提供较便捷的平台，能够用于代谢物的定量分析和生物体整体代谢变化研究，具有普适性。经方法学考察本发明建立的上述拟靶向代谢组方法符合方法学的各项要求。通过应用于小鼠血浆和肝脏中代谢物检测可见，该方法具有良好的适用性。

5、结合第一方面，所述高分辨四级杆质谱的优选采用以nfswi-dda模式采集数据。本发明通过实验研究发现，通过nfswi-dda模式可获取与nfswi-dia模式相当的有效ms2信息丰度，而定量精密度无显著性差别。同时，nfswi-dda模式ms2的定性可靠性显著高于nfswi-dia模式。相较于单纯的dda模式ms2丰度低和dia模式ms2可靠性低、数据处理复杂，nfswi-dda模式同时具有ms覆盖度高、精密度好、图谱质量高、数据处理便捷的优势。nfswi-dda模式同时具有dda模式ms2数据可靠、定性准确以及dia模式ms2覆盖率高、定量精密度好的特点。

6、结合第一方面，所述待测生物样品包括经预处理的血液样品或肝脏样品；其中对血液样品进行预处理的操作包括：将所述血液样品与内标溶液和沉淀蛋白的溶剂混合，冰水浴超声处理后离心，取上清，氮吹干，检测前复溶，离心，取上清；对肝脏样品进行预处理的操作包括：用生理盐水对所述肝脏样品进行组织匀浆，得匀浆液，将所述匀浆液与内标溶液和沉淀蛋白的溶剂混合，冰水浴超声处理后离心，取上清，氮吹干，检测前复溶，离心，取上清；所述沉淀蛋白的溶剂为25％～100％v/v甲醇水溶液，50％～75％v/v甲醇乙腈溶液或乙腈，所述复溶的溶剂为25％～100％v/v甲醇水溶液，50％～75％v/v甲醇乙腈溶液或乙腈。

7、优选地，所述沉淀蛋白的溶剂为50％v/v甲醇乙腈溶液，所述复溶的溶剂为75％v/v甲醇乙腈溶液或75％v/v甲醇水溶液。采用50％v/v甲醇乙腈溶液沉淀蛋白时，最低响应值和低含量成分的响应值均较高，采用75％v/v甲醇乙腈溶液或75％v/v甲醇水溶液复溶时，提取特征峰响应占比、总响应值、最大值和最小值均表现较好。

8、结合第一方面，当所述质谱为所述高分辨四级杆质谱的质谱条件时，所述液相色谱-质谱联用技术包括反相色谱柱条件下的液质联用以及氨基色谱柱条件下的液质联用。

9、优选地，所述反相色谱柱条件下的液质联用中，色谱条件包括：

10、色谱柱为csh c18色谱柱；

11、流动相a为体积比为1:1的乙腈-甲醇，流动相b为含5mm甲酸铵的水，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：0-1min：99％ b；1-3min：99％ b-50％b；3-8min：50％ b-1％b；8-9min：1％ b；

12、柱温为35～45℃；流速为0.3ml/min；

13、质谱条件包括：在全扫描(full scan)模式下获取生物样品的特征峰q1的丰度，ms1全扫描范围是100～1000，分辨率是120000；之后以nfswi-dda或nfswi-dia模式采集数据。

14、优选地，所述反相液相色谱条件中，色谱柱为uplc cshtm c18(waters，2.1×100mm，1.7μm)；

15、优选地，所述质谱条件还包括：电喷雾离子源，辅助气流速为7arb，鞘气流速为35arb，毛细管温度为320℃，雾化气温度为420℃，正离子喷雾电压为3.50kv，负离子喷雾电压为2.80kv，碰撞能nce分别设置为10、20、30、40和50v。

16、优选地，所述氨基色谱柱条件下的液质联用中，色谱条件包括：

17、色谱柱为beh amide色谱柱；

18、流动相a为体积比为95:5的乙腈-水，并含5mm甲酸铵，流动相b为体积比为95:5的水-乙腈，并含5mm甲酸铵；进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：0-17min：5％ b-40％ b；17-20min：40％ b；20-23min：40％ b-5％ b；

19、柱温为45℃；流速为0.2ml/min；

20、质谱条件包括：采用full-ddms2模式采集数据，full scan分辨率：60000，ddms2分辨率：30000；电喷雾离子源；辅助气流速为7arb；鞘气流速为35arb；毛细管温度为320℃；雾化气温度为420℃；喷雾电压为3.50kv(pos)或2.80kv(neg)；碰撞能nce为15/30/45v。

21、结合第一方面，当所述质谱为三重四级杆质谱时，所述液相色谱-质谱联用技术包括反相色谱柱条件下的液质联用以及氨基色谱柱条件下的液质联用。

22、优选地，所述反相色谱柱条件下的液质联用中，色谱条件包括：

23、色谱柱为csh c18色谱柱；

24、流动相a为体积比为1:1的乙腈-甲醇，流动相b为含5mm甲酸铵的水，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：0-4min：99％ b-97％ b；4-7min：97％b-80％ b；7-16min：80％b-0％ b；16-18min：0％ b；

25、柱温为40～50℃；流速为0.5ml/min；

26、质谱条件包括：正离子和负离子模式分别检测；毛细管电压：+3.5kv/-2.8kv；锥孔电压：30v；毛细管温度：500℃；去溶剂化温度：450℃；去溶剂气流量为1000l/hr；1000l/hr；辅助气：50l/hr，检测模式采用mrm模式。

27、优选地，所述氨基色谱柱条件下的液质联用中，色谱条件包括：

28、色谱柱为beh amide色谱柱；

29、流动相a为体积比为95:5的乙腈-水，并含5mm甲酸铵，流动相b为体积比为95:5的水-乙腈，并含5mm甲酸铵；进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：0-17min：5％ b-40％ b；17-20min：40％ b；20-23min：40％ b-5％ b；

30、柱温为45℃；流速为0.2ml/min；

31、质谱条件包括：正离子和负离子模式分别检测；毛细管电压：+3.5kv/-2.8kv；锥孔电压：30v；毛细管温度：500℃；去溶剂化温度：450℃；去溶剂气流量为1000l/hr；1000l/hr；辅助气：50l/hr，检测模式采用mrm模式。

32、结合第一方面，所述色谱柱为uplc cshtm c18、acquity uplc beh amide、lunaomega polar c18或cortecs uplc t3。用以上色谱柱得到的特征峰累计响应值较高，能够更好地满足检测需求。其中uplc cshtm c18反相色谱柱在代谢组学研究中未见报道。

33、本发明的有益效果在于：本发明结合dda和dia优势的非固定分段窗口间隔数据依赖采集策略，该策略在hrms质谱仪上普遍适用，减少了拟靶向方法建立的仪器局限性，也为ms2信息的获取模式提供了新视角。本发明基于nfswi-dda模式建立的定量和半定量相结合的拟靶向代谢组方法能够满足精准医学研究对代谢物覆盖率、定量稳定性和检测通量的要求，可用于多种生物样品中代谢物(包括改变和未改变的代谢物)的检测，具有适用性，将为疾病诊断、药物开发、生物标志物发现提供技术支持。经检验，基于此建立的拟靶向代谢组学方法共可检测mrm离子对3002个，其中正离子模式1633个，负离子模式1369个，经注释的代谢物475个(其中327个代谢物绝对定量)，且线性、精密度、重复性、回收率、基质效应和稳定性良好，可用于475个代谢物相对定量的分析。这些代谢物涵盖9大代谢通路，包含二级代谢通路65条，能反映体内基本代谢过程。因此，该检测方法可用于代谢物的鉴定以及代谢途径分析。应用分析结果显示，正常组和脂多糖(lps)诱导肝损伤模型组血浆和肝脏的qc样本分别紧密聚在一起，代谢物在小鼠血浆和肝脏中的检出率均达400+，说明该方法稳定且适用于多种生物样本的检测。