用于人血浆中18-OHB及其干扰物鉴定并准确定量的液相色谱串联质谱方法

本发明涉及医学指标定量分析，尤其涉及一种用于人血浆中18-ohb及其干扰物鉴定并准确定量的液相色谱串联质谱方法。

背景技术：

1、类固醇激素是一类经类固醇生成组织和/或器官合成分泌的具有环戊烷多氢菲母核的小分子物质，相对分子质量在200~400da。依据发挥的生物学效应差异，可以分为盐皮质激素、糖皮质激素、性激素（雄激素、雌激素和孕激素）三大类。其中，18-羟皮质酮（18-hydrocorticosterone，18-ohb）作为典型的盐皮质激素醛固酮的重要合成中间物质，在维持人体水盐平衡和正常血压方面具有重要生理意义，同时在高血压诊断和分型中发挥作用。

2、原发性醛固酮增多症（praimary aldosteronism，pa）作为最常见的继发性高血压类型，依据对治疗手段的有效性差异可大致区分为醛固酮腺瘤（aldosterone-producingadenoma，apa）和双侧肾上腺增生（bilateral adrenal hyperplasia，bah）。前者对肾上腺切除术敏感而后者对螺内酯等降压药物治疗有效（funder jw, carey rm, mantero f,murad mh, reincke m, shibata h, et al. the management of primaryaldosteronism: case detection, diagnosis, and treatment: an endocrine societyclinical practice guideline. the journal of clinical endocrinology&metabolism2016;101:5:1889-916 as doi: 10.1210/jc.2015-4061.）。但目前区分这两个亚型的传统“金标准”是通过肾上腺静脉取血来确定侧化率，其操作繁琐、耗时、价格昂贵、具有技术依赖性，存在取血失败的风险，普及程度低。因此临床在实现pa准确分型的道路上仍旧挑战重重。据文献报道，pa患者相较于其他高血压患者具有更高的18-ohb水平，同时apa相较于bah患者也表现出更高的18-ohb水平（gao y, xie s, liu s, lu y, zhang f, qiu l, tonga: application of the steroid profiling detecting by lc-ms/ms in thediagnosis of primary aldosteronism. basic and clinical medicine 2022, 42(12):1835-1840.）。18-ohb与其他激素如18-羟皮质醇（18-hydroxycortisol, 18-ohf）、18-氧皮质醇（18-oxocortisol，18-oxof）的联合应用，也有望提高pa的分型能力。因此实现18-ohb的准确定量对简便、快捷诊断pa以及区分不同亚型的pa意义重大。

3、高效液相色谱串联质谱技术（liquid chromatography-tandem massspectrometry，lc-ms/ms）联合了液相色谱的高效分离能力和质谱的联合质荷比（m/z)的高区分能力，已逐渐取代既往缺陷显著（如存在交叉反应、线性范围窄等）的免疫学方法，成为目前检测类固醇激素的主流推荐检测手段。

4、chen f等人利用 waters® xevo™ tqs ms acquity uplc® 系统建立了同时检测人血浆中18-ohb、18-ohf、18-oxof的lc-ms/ms检测方法(chen f, cheng z, wang z,peng y, wang b, guo w, pan b. liquid chromatography-tandem mass spectrometry(lc-ms/ms) based assay for the simultaneous quantification of 18-hydroxycorticosterone, 18-hydroxycortisol and 18-oxocortisol in human plasma.journal of chromatography b 2022;1188 as doi: 10.1016/j.jchromb.2021.123030.)，采用96-well oasis prime hlb μelution column plate进行样本前处理；色谱分离条件为，采用色谱柱acquity uplc hss pfp column (100 mm ×2.1 mm, 1.8 μm) (milford waters, ma, usa)，a相：0.1%甲酸水，b相：乙腈洗脱。该方法仅针对18-ohb、18-ohf、18-oxof进行定量，非18-ohb与20α-dhe同步定量检测的方法，且文献也未通过干扰试验评估18-ohb的血浆内源性干扰物，如20α-dhe、皮质醇、可的松等的可能影响。因此，尽管目前已有联合定量18-ohb和其他激素的lc-ms/ms方法（mulatero p, dicella sm, monticone s, schiavone d, manzo m, mengozzi g, et al. 18-hydroxycorticosterone, 18-hydroxycortisol, and 18-oxocortisol in thediagnosis of primary aldosteronism and its subtypes. the journal of clinicalendocrinology&metabolism 2012;97:3:881-9 as doi: 10.1210/jc.2011-2384），但是本团队在建立包括18-ohb在内的人血浆中24种类固醇激素的定量方法（yu s, yin y, zouy, li q, yu j, xie s, et al. a comprehensive lc-ms/ms method for thesimultaneous measurement of 24 adrenal steroids: from research to clinicalpractice. journal of chromatography b 2024;1232:123941 as doi: 10.1016/j.jchromb.2023.123941.）时，就发现18-ohb非常容易受到内源性干扰物质，如皮质醇、可的松的影响，尤其是在液相条件不适合的情况下，可能存在高响应峰包裹低响应峰的情况，但与18-ohb结构类似的其他内源性干扰物的存在在既往其他发表文献中并未强调。同时既往方法建立的相关文献缺乏对干扰试验评估的详细描述，因此尽管方法的其他性能验证通过，也不排除存在潜在干扰物影响的可能。

5、arioli f等人利用离子阱质谱技术（ltq® 线性离子阱联合电喷雾质谱技术，建立了定量尿液游离皮质醇及包括20α-双氢可的松（20α-dihydrocortisone，20α-dhe）在内的15种内源性代谢产物的lc-ms/ms检测方法（arioli f, gamberini mc, pavlovic r, etal. quantification of cortisol and its metabolites in human urine by lc-msn:applications in clinical diagnosis and anti-doping control. anal bioanalchem. 2022;414(23):6841-6853. doi:10.1007/s00216-022-04249-3.）。该方法针对20α-dhe的lc-ms/ms定量方法采用人尿液样本而非人血浆样本，与皮质醇及其他代谢物同测，并未实现与18-ohb这类区分难度大的物质的联合测定。因此，尽管很早就有文献探究20α-dhe可能会干扰尿液中皮质醇的检测（israelsson m, brattsand r, brattsand g. 20α- and20β-dihydrocortisone may interfere in lc-ms/ms determination of cortisol insaliva and urine. ann clin biochem. 2018;55(3):341-347. doi:10.1177/0004563217724178.），但是前期文献检索未发现到可实现18-ohb与20α-dhe联合测定的lc-ms/ms方法，且未有文献探究人血浆中18-ohb与20α-dhe相互干扰的情况。临床数据分析已知20α-dhe这个皮质醇下游代谢物可以存在于人血浆中，且响应不低，但是现有文献报道都是在人尿液、胎盘灌注液（dodds hm, taylor pj, cannell gr, pond sm. a high-performance liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometryanalysis of cortisol and metabolites in placental perfusate. anal biochem.1997;247(2):342-347. doi:10.1006/abio.1997.2074.）中实现20α-dhe的单独检测，而缺乏在人血浆中实现其准确定量的方法报道。

6、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明基于实验室数据，采用高分辨质谱技术识别并鉴定了人血浆中影响18-ohb定量的内源性干扰物质20α-dhe，并首次建立了同步测定人血浆中18-ohb和20α-dhe的lc-ms/ms方法。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种用于人血浆中18-ohb和20α-dhe准确定量的液相色谱串联质谱方法，包括：在液相色谱过程中，选用含有0.025±0.005mm氟化铵的去离子水作为流动相a，选用乙腈作为流动相b，利用梯度洗脱分离人血浆样品中的18-ohb和20α-dhe，对分离后的18-ohb和20α-dhe进行同步定量。

4、本发明识别并鉴定20α-dhe对18-ohb存在定量干扰。本发明通过优化色谱条件，成功利用色谱法实现了20α-dhe和18-ohb的分离，并实现了20α-dhe和18-ohb同步定量。

5、优选地，洗脱梯度为：0-1min, 16% b, 1-6min, 16%-20% b, 6-9min, 20%-95%b, 9-10min, 95%b, 10min, 16% b。

6、优选地，色谱柱选用waters acquity uplc beh c8 column (100 mm × 2.1 mm,1.8 μm) 。

7、优选地，柱温50±2℃。

8、优选地，流动相流速0.3±0.1 ml/min。

9、优选地，所述用于人血浆中18-ohb和20α-dhe准确定量的液相色谱串联质谱方法还包括：对分离后的内源性干扰物20α-dhe进行分离和定量。

10、优选地，18-ohb在质谱中所产生的检测信号的母离子具有363.160±0.5的质荷比；包含质荷比为146.990±0.5、269.075±0.5的子离子；驻留时间为0.025±0.01msec；锥孔电压为40±2 v；碰撞能为16±2 ev。

11、优选地，20α-dhe在质谱中所产生的检测信号的母离子具有363.170±0.5的质荷比；包含质荷比为163.130±0.5、267.140±0.5的子离子；驻留时间为0.025±0.01msec；锥孔电压为6.0±2.0 v；碰撞能为25±2 ev。

12、优选地，以18-ohb-d4为内标，18-ohb-d4在质谱中所产生的检测信号的母离子具有367.160±0.5的质荷比；包含质荷比为273.026±0.5的子离子；驻留时间为0.025±0.01msec；锥孔电压为40±2 v；碰撞能为16±2 ev。

13、优选地，质谱条件还包括：利用沃特世acquity i-class高效液相色谱串联waterstq-s三重四级杆质谱进行多反应检测模式的lc-ms/ms定量检测；毛细管电压2.5±0.1kv；锥孔电压50±2v；脱溶剂气温度550±5℃；脱溶剂气流速1100±50l/h；进样锥气体流速150±5 l/h。

14、优选地，18-ohb-d4使用等体积混合的甲醇和水混合液配置成40±5ng/ml的工作浓度；18-ohb和20α-dhe分别使用等体积混合的甲醇和水混合液配置成100±5μg/ml的次级母液，接着使用等体积混合的甲醇和水混合液稀释成含有两种标准品系列浓度的次级混合校准液，再将次级混合校准液与无激素血浆混合成10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25, 0.1,0.05 ng/ml的工作浓度。

15、优选地，18-ohb和20α-dhe的加标回收率均在90%~110%范围内；18-ohb的批次间变异系数为3.6%～4.3%；批次内变异系数为2.7%～4.5%；20α-dhe的批次间变异系数为3.0%～9.0%，批次内变异系数为2.7%～3.5%。

16、有益效果：

17、本发明识别并鉴定了影响人血浆中18-ohb准确定量的内源性干扰物质，确认内源性激素代谢物20α-dhe对18-ohb存在定量干扰，并首次建立了同步测定人血浆中18-ohb与干扰物20α-dhe的lc-ms/ms定量方法。该方法性能优良，具有良好的回收率和检测精密度。