一种胎盘生长因子可溶性fms样酪氨酸激酶检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析，尤其是涉及一种胎盘生长因子可溶性fms样酪氨酸激酶检测试剂盒。

背景技术：

1、胎盘生长因子(plgf)的分泌异常可能跟异位妊娠，先兆流产，先兆子痫、胎儿生长受限以及妊娠相关并发症相关。检测孕妇血液胎盘生长因子水平在临床上可以对孕妇子痫前期进行预测、鉴别和治疗监测。可溶性fms样酪氨酸激酶1(soluble fms like tyrosinekinasel,sflt-1)是一种具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白，

2、在子宫胎盘缺血缺氧的情况下，其表面会释放过量的抗血管生成因子sflt-1进入母体血液循环，引发血管收缩和血管内皮损伤。因此，plgf/sflt-1联合检测在子痫前期短期预测方面的临床价值已获得日益广泛的认可。目前市场上的试剂盒大多是以单独的plgf试剂盒。同时对plgf/sflt-1联合检测的产品市场存在很大的空白。利用两者联合检测比采用单独检测plgf更有意义。目前检索到cn118209720a(发明实审)，采用将量子点标记抗体冻干成粉末状态以便长期保存，冻干需要经过预冻-冷冻-真空干燥等步骤，过程比较繁琐且耗能较大，检测时吸取100ul样本加入冻干标记物中混合5min，混均后吸取80ul混合物加入加样孔中进行检测，10min后分析仪判读出结果。而本发明中采用直接将量子点标记的抗体喷涂于结合垫上再经过简单的干燥工艺即可，测试时直接取75ul样本加入加样孔进行测试，12min后分析仪判读出结果，相对简单，样本用量少，测试快。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种胎盘生长因子可溶性fms样酪氨酸激酶检测试剂盒。本发明将量子点荧光微球标记的plgf和sflt-1抗体络合物直接喷涂在结合垫上，并将相应的另一种抗体plgf和sflt-1分别划在nc膜上。采用直接加样的方式对plgf/sflt-1进行同时测定。本发明可以很好为plgf/sflt-1相关产品的开发提供技术参考，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胎盘生长因子可溶性fms样酪氨酸激酶检测试剂盒，包括样本垫、吸收垫、结合垫以及nc膜；

3、所述nc膜上分布有质控线、测试线一与测试线二。

4、优选地，所述测试线一为胎盘生长因子，所述测试线二为可溶性fms样酪氨酸激酶。

5、一种胎盘生长因子可溶性fms样酪氨酸激酶检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

6、将量子点荧光微球标记的plgf、sflt-1和质控抗体用络合物稀释液配置成一定浓度的混合液，喷涂于结合垫上，络合物稀释液里含有磷酸盐、牛血清白蛋白和防腐剂成分。

7、在测试时直接将75ul的样本加到反应板条的加样孔中，12min后即可测试出plgf/sflt-1结果值。

8、测试反应原理是样本加入到加样孔后，通过样本垫加样端由毛细作用力向左扩散流入到结合垫后，将结合垫上喷涂的量子点荧光微球标记的plgf、sflt-1抗体络合物在硝化纤维基质的测试带上扩散，形成plgf、sflt-1复合物，并被测试带上的另一个plgf、sflt-1抗体所捕获，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物。

9、当血液中的plgf、sflt-1抗原越多，测试带上的抗体夹心复合物积聚的也多；

10、荧光信号的强度反映了被捕获的plgf和sflt-1抗原数量，经过配套的免疫荧光分析仪的判读，能够检测出血液样本中plgf和sflt-1抗原的浓度，并根据两者之间值得到plgf/sflt-1比值。

11、所述免疫荧光分析仪的判读系统包括：

12、光源系统、样品处理系统、光学检测系统、信号处理和放大系统、数据分析系统、反馈控制系统。

13、所述光源系统包括激光/led光源选择：选择波长与荧光染料的激发波长相匹配的光源，并且光源的功率应足够高以确保激发的荧光信号强度；光源调节：通过反馈控制系统，实时调节光源的强度和稳定性，保证在不同样品和染料浓度下获得最优的激发效果；

14、所述样品处理系统包括：高效抗体标记：采用高亲和力的量子点荧光微球标记抗体，确保目标抗原的有效识别和标记，减少非特异性结合带来的背景信号自动化处理：使用自动化样品处理设备，实现样品的精准制备、染色和洗脱，降低人工操作误差，提高检测的一致性；

15、所述光学检测系统包括高灵敏度探测器：选用高量子效率的探测器，以捕捉弱荧光信号；优化光路设计：通过优化滤光片组和透镜组的设计，最大限度地减少光损失和噪声干扰，确保荧光信号的高效传输；多通道检测：实现多通道检测，能够同时采集多种荧光信号，提高检测通量和效率。

16、所述信号处理和放大系统包括：

17、信号放大：使用高增益的放大电路对探测器采集的信号进行放大，同时通过滤波技术抑制背景噪声，确保信号的清晰度；

18、数字信号处理：通过dsp(数字信号处理)技术，对放大的信号进行实时处理，提取有用的荧光信息，并去除噪声和干扰；

19、设信号放大后的强度为s，原始信号为s0，噪声为n，放大系数为g，则有：

20、s＝g·s0

21、信噪比snr为：

22、

23、通过调整g和n，优化信噪比。

24、优选地，所述数据分析系统包括：图像处理：应用先进的图像处理算法，采用卷积神经网络，对荧光图像进行背景校正、边缘检测、信号分离处理，提升信号的分辨率和定量精度；基于卷积神经网络模型进行图像处理，设输入图像为x，输出判读结果为y，模型权重为w，则有：

25、y＝f(x,w)

26、其中f为卷积操作和激活函数的组合；

27、自动判读：建立基于机器学习的自动判读系统，能够根据荧光信号强度和分布模式，自动判断检测结果，并输出分析报告,设光源强度为i0，荧光强度为if，则有：

28、if＝k·i0·ò·c

29、其中k为常数，ò为荧光染料的激发效率，c为样品中荧光分子的浓度；

30、动态调整：根据实时检测的数据，自动调整光源强度、探测器灵敏度等参数，确保在不同样品条件下都能获得最佳检测效果；

31、所述提高灵敏度的优化步骤具体包括：

32、增强荧光信号：信号增强策略：采用信号增强策略，使用金属增强荧光或多层膜结构，以增强荧光分子的发射强度；

33、长波长荧光染料：选择长波长的荧光染料以减少背景荧光的干扰，提升检测信噪比；

34、抑制背景信号：优化抗体设计：通过设计抗体的高选择性结合位点，减少非特异性结合产生的背景信号；

35、涤步骤优化：优化洗涤步骤，确保未结合的荧光标记抗体被充分洗除，降低背景噪声；

36、动态调整与反馈控制：实时参数调整：利用反馈控制系统，根据检测过程中荧光信号的强度，实时调整光源、探测器、以及样品处理条件，实现自适应优化，确保每次检测的高灵敏度和准确性

37、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

38、此发明将量子点荧光微球标记的抗体直接喷涂在结合垫上，只需1次加样就可以同时实现对plgf/sflt-1的测定，采用直接加样的方法对样本进行测试。提高实验过程中试剂盒的灵敏度和准确性，并使实验的操作过程更加简单方便，可实现试剂盒的常温存储与运输。

39、1、量子点免疫荧光层析法与胶体金免疫层析法类似,有着反应时间短、检测设备小以及可床旁检测等优势。

40、2、量子点免疫层析技术是以量子点作为示踪标志物应用于免疫层析法中，它一方面利用了量子点的独特荧光作为观测信号，具有灵敏度高、干扰小、快速的优点，另一方面利用了免疫层析技术的简便、特异性强、费用低等优点。

41、3、制备低廉、稳定性好、易于保存，利用量子点荧光微球标记方法检测灵敏度高、特异性强的优点，比较容易地在临床进行推广。

42、4、量子点荧光微球得益于高发光性能、优异光学稳定性、良好的信噪比，超敏项目测试变为可能。作为新型量子点物，灵敏度可与化学发光平台媲美。

43、综上所述，量子点集中了大量的光学特性，使得量子点在多元化的，高灵敏度、高稳定性的分析研究中显示出其巨大的价值及前景。同样，这也使得新型量子点免疫荧光层析法未来前景不可估量。这种新的免疫层析分析法可推广至食品分析、临床检验等相关领域