一种用于测定雌二醇的试剂盒的制作方法

本发明涉及检测试剂盒，具体涉及一种用于测定雌二醇的试剂盒。

背景技术：

1、雌二醇(estradiol，e2)是人体内生物活性最强的一种雌激素，分子量272.3道尔顿，主要由卵巢分泌，肾上腺和男性的睾丸也可少量分泌。血液中大部分的e2与性激素结合球蛋白结合，只有1-3％的e2是游离的。e2主要促进女性生殖上皮、乳腺、子宫、长骨生长及第二性征发育。e2增高常见于女性各类性早熟等，男性的e2水平异常高表明有女性化综合症，比如男性乳房发育。e2缺乏将导致闭经、生殖器萎缩及骨质疏松和心血管疾病等。可影响女性第二性征的发育。因此e2的测定对于监测排卵、分析性发育状况，无月经病因，不孕和绝经的成因都很有价值。

2、目前，国产厂家大多数采用竞争法测定雌二醇的含量，但竞争法由于方法学的缺陷普遍存在灵敏度偏低，所以逐渐采用小分子夹心法检测雌二醇，提高雌二醇测定的灵敏度，但是实验过程中由于小分子夹心法采用的是基于抗免疫复合物的夹心法，抗免疫复合物抗体是针对抗原与抗体结合后形成的新抗原表位所产生的特异性抗体，这种基于免疫复合物的夹心法相较于传统夹心法识别抗原上不同的线性表位而言，会导致较高的背景信号，影响试剂盒的灵敏度的测定。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是现有技术中的试剂盒由于背景信号高而导致检测灵敏度较差，目的在于提供一种用于测定雌二醇的试剂盒，通过在原料标记时，改变抗体与碱性磷酸酶和固相磁珠的耦连方式，以降低试剂盒反应的背景信号，从而解决检测灵敏度差的问题。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、一种用于测定雌二醇的试剂盒，包括雌二醇兔单克隆抗体包被的磁珠、缓冲液和鼠单克隆雌二醇抗体标记的酶工作液。

4、作为一种可能的设计，上述雌二醇兔单克隆抗体包被的磁珠通过如下方法制备：

5、将雌二醇兔单克隆抗体与长链bnhs(nhs-lc-lc-biotin)耦连后，与链霉亲和素磁珠偶联，再用维生素h进行磁珠封闭。

6、优选的，上述雌二醇兔单克隆抗体经pbs溶液透析处理后，再与长链bnhs耦连。

7、作为一种可能的设计，上述长链bnhs浓度为10～20mmol/l；所述链霉亲和素磁珠浓度为100mg/ml；所述维生素h浓度为10mg/ml。

8、优选的，上述链霉亲和素磁珠先经过磁性分离，去除上清液，用tris溶液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)磁性分离洗涤，再进行偶联。

9、优选的，上述链霉亲和素磁珠与耦联后的雌二醇兔单克隆抗体偶联时，磁珠保持悬浮状态。

10、作为一种可能的设计，上述鼠单克隆雌二醇抗体标记的酶工作液通过如下方法制备：

11、将alp(碱性磷酸酶)活化，得到标记的alp，并将鼠单克隆雌二醇抗体与2it(2亚氨基硫烷盐酸盐)耦连，得到标记的雌二醇抗体，再将标记的alp和标记的雌二醇抗体耦连。

12、优选的，上述标记的alp在活化后加入甘氨酸溶液终止反应。

13、作为一种可能的设计，上述alp活化是通过sm(peg)12(琥珀酰亚胺-马来酰亚胺12peg)或sulfo-smcc(磺基琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐)；sulfo-smcc和sm(peg)12浓度均为30mg/ml；所述鼠单克隆雌二醇抗体浓度为1mg/ml；所述2it浓度为10mg/ml。

14、优选的，上述alp先经过三乙醇胺溶液稀释至10mg/ml，上述sulfo-smcc或sm(peg)12先经过dmf(二甲基甲酰胺)溶解至30mg/ml，再进行活化。

15、优选的，上述sulfo-smcc或sm(peg)12溶液和alp溶液的体积比为1：20。

16、作为一种可能的设计，上述标记的alp和标记的雌二醇抗体耦连后，还与nem(n-乙基马来酰亚胺)反应；所述nem浓度为10mg/ml。

17、优选的，上述nem经三乙醇胺溶液稀释后再使用，稀释后nem浓度为1mg/ml。

18、优选的，上述标记的alp和标记的雌二醇抗体耦连，加入nem后，反应5～15min后终止反应。

19、优选的，上述在终止反应后，用0.5％酪蛋白缓冲液按1/2000将酶标记的抗体进行稀释，得到酶工作液。

20、作为一种可能的设计，上述标记的alp和标记的雌二醇抗体耦连后，用tris溶液定容，不使用nem反应。

21、作为一种可能的设计，上述雌二醇兔单克隆抗体包被的磁珠通过如下方法制备：

22、将雌二醇兔单克隆抗体与生物素酯耦连后，与链霉亲和素磁珠偶联，再用维生素h进行磁珠封闭。

23、优选的，上述雌二醇兔单克隆抗体经pbs溶液透析处理后，再与生物素酯反应并透析。

24、优选的，上述生物素酯为长链生物素酯。

25、优选的，上述链霉亲和素磁珠先经过磁性分离，去除上清液，用tris溶液磁性分离洗涤，再进行偶联。

26、优选的，上述链霉亲和素磁珠与耦联后的雌二醇兔单克隆抗体偶联时，磁珠保持悬浮状态。

27、作为一种可能的设计，上述生物素酯浓度为10mmol/l；所述链霉亲和素磁珠浓度为100mg/ml；所述维生素h浓度为10mg/ml。

28、作为一种可能的设计，上述鼠单克隆雌二醇抗体标记的酶工作液通过如下方法制备：

29、将alp通过satp(n-琥珀酰亚胺-s-乙酰巯基丙酸酯)活化，得到标记的alp，并将鼠单克隆雌二醇抗体通过smph(琥珀酰亚胺6-(β-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸)活化，得到标记的雌二醇抗体，再将标记的alp和标记的雌二醇抗体耦连。

30、优选的，上述alp先经过三乙醇胺溶液稀释至10mg/ml，satp使用dmso(二甲基亚砜)溶解至10mg/ml，再进行活化。

31、优选的，上述alp通过satp活化后，通过加入盐酸-赖氨酸溶液终止反应，并透析，得到ap-satp溶液。

32、优选的，上述鼠单克隆雌二醇抗体通过smph活化后，通过加入盐酸-赖氨酸终止反应，并透析。

33、优选的，上述ap-satp溶液加入羟胺溶液滚动反应，再加入标记的雌二醇抗体反应，加入盐酸羟胺调整浓度为10mmol/l，滚动反应。

34、作为一种可能的设计，上述satp浓度为10mg/ml；所述smph的浓度为20mg/ml。

35、优选的，上述缓冲液的制备方法如下：

36、用纯化水将小牛血清稀释至浓度为100ml/l。

37、本发明提供的试剂盒有三种方案：

38、第一种是使用长链生物素酯标记兔克隆雌二醇单抗与链霉亲和素磁珠耦连；酶端alp(碱性磷酸酶)使用sm(peg)12进行标记，鼠克隆单抗使用2it进行标记，使用标记的鼠克隆单抗与活化的alp进行耦连，分别作为r1和r2组成试剂盒。

39、第二种是使用长链生物素酯标记兔克隆雌二醇单抗与链霉亲和素磁珠耦连；酶端alp(碱性磷酸酶)使用sulfo-smcc进行标记，雌二醇鼠克隆单抗使用2it进行标记，使用标记的鼠克隆单抗与活化的alp进行耦连，分别作为r1和r2组成试剂盒。

40、第三种是使用长链生物素酯标记兔克隆雌二醇单抗与链霉亲和素磁珠耦连；酶端alp(碱性磷酸酶)使用satp标记，雌二醇鼠单克隆抗体使用smph进行标记，使用标记的鼠克隆单抗与活化的alp进行耦连，分别作为r1和r2组成试剂盒。

41、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

42、本发明通过使用特异性识别雌二醇抗原位点的抗体，利用特殊的抗原标记，通过改变固相磁珠和酶标抗体的链接方式，在检测时能够显著降低背景信号，且具有优异的检测灵敏度。本发明的第一种标记方案使用sm(peg)12链接酶端抗体与alp，使用peg修饰的交联剂可以提高修饰蛋白的稳定性，溶解度，降低聚合的可能性，降低其抗原性，增大酶端复合物的分子量和空间位阻，使其减小与磁珠端的吸附，降低反应信号，同时达到降低背景信号提高试剂灵敏度的效果，使得其0浓度点与15浓度点信号差异大，低端灵敏度最优，进而使得样本的低端测值精确。