一种体外评估化妆品原料及成品神经美容功效的方法与流程

本发明属于化妆品检测领域，具体涉及一种体外评估化妆品原料及成品神经美容功效的方法。

背景技术：

1、随着护肤心态从外向内的转变，赋予人“愉悦和幸福的感觉”逐渐成为化妆品行业的一种流行元素。在过去几年，“情绪”、“沉浸式”的标签也逐渐成为了流量密码，“情绪护肤”也就应运而生。情绪护肤是通过调节情绪(视觉、触觉、嗅觉、味觉等途径)来改善皮肤状态，实际上它更倾向于是一种“消费概念”。化妆品精致的包装、香气、柔顺的触感等等均能提供一种愉悦的感官体验，而这种调节情绪的能力则很容易与“神经美容”相混淆。尽管“情绪护肤”与化妆品功效存在本质区别，但不可否认人们越来越追求化妆品所承载的“情绪价值”，而“神经美容”能更精准地做到这一点。

2、皮肤是神经系统的延伸，许多皮肤问题跟神经系统存在密切联系。因此，近些年来皮肤外周神经系统逐渐发展成为抗衰的新靶点，并由此衍生出了许多神经美容化妆品。作为一种能影响皮肤-大脑连接的新型护肤机制，神经美容是通过作用于皮肤的神经介质来表现出对皮肤神经系统的活性，最终达到护肤功效。神经美容的主要作用机制为：作为神经递质释放的调节剂直接作用于神经末梢；作为神经肽受体的激动剂或抑制剂以及神经递质效应的调节剂作用于非神经细胞。当前市面上的神经美容化妆品主要宣称对抗皮肤压力、抑制炎症和缓解肌肤敏感等来发挥护肤功效。其中，皮质醇和β-内啡肽这两种神经介质常被作为神经美容化妆品的作用靶标。此外，作为能介导神经活动的一种皮肤痛痒感受器，trpv1也是神经美容活性原料的重要靶标之一。

3、目前国内外对于神经美容的研究较少，也并未形成系统的神经美容效果和作用机制的检测方法，对神经美容化妆品功效的评估显然还不够全面、客观。专利文献cn202110597570.3公开了一种基于人体的神经美容效果评价方法，通过检测受试者的脑电波、心率等情况来评价皮肤外用剂的神经美容效果，但该方法对人员、设备要求较高，不适用于化妆品原料研发前期工作的机理研究和高效筛选。当下，体外替代实验逐渐成为主流的化妆品功效评价方法，其中，细胞模型相对而言条件更为可控，且实验周期短、成本低，能结合多种技术手段获得更微观的数据，在挖掘作用机制方面具有一定的研究意义，因此成为了体外替代实验中的优良实验模型。故而，构建体外细胞评价模型有助于更为经济高效地实现神经美容活性原料以及神经化妆品的开发和高通量筛选。

4、因此，为了科学认识神经和皮肤的联系，更准确地评价化妆品原料及成品的护肤作用，规范神经美容化妆品市场，推动化妆品行业的进步，建立一种能够系统评估化妆品神经美容功效的体外方法是有必要的。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是，提出一种体外评估化妆品原料及成品神经美容功效的方法，以填补化妆品原料神经美容功效体外实验室评价方法的空缺，针对神经美容的不同作用机制，分别构建评估对抗皮肤压力和缓解神经敏感作用的三种细胞模型。通过对测试结果进行综合分析来系统评价目标原料及成品的神经美容活性，具有操作简易、全面、快速高效、准确的技术优势，可为神经美容化妆品的研发、复配和筛选提供依据。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种体外评估化妆品原料及成品神经美容功效的方法，包括以下步骤：

3、s1，评估待测样品的溶解性，确定溶解方案，所述待测样品包括化妆品原料和化妆品成品；

4、s2，选择细胞，所述细胞包括人角质形成细胞；

5、s3，取对数生长期的细胞进行培养，采用cck-8试剂或mtt试剂测定不同浓度待测样品对细胞的毒性，筛选出细胞活力≥90％所对应的待测样品的浓度作为给药浓度；

6、s4，建立可的松诱导细胞皮质醇分泌模型，检测待测样品给药浓度下的皮质醇分泌水平；

7、s5，建立细胞β-内啡肽分泌模型，检测待测样品给药浓度下的β-内啡肽分泌水平；

8、s6，建立辣椒碱刺激细胞trpv1模型，检测待测样品给药浓度下的细胞钙离子内流水平；

9、上述步骤s4、s5和s6为任选至少一个步骤。

10、可选的，所述建立可的松诱导细胞皮质醇分泌模型，包括：

11、取对数生长期的细胞进行培养；

12、设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和样品组，其中，空白对照组加入细胞培养基，阴性对照组加入含可的松的细胞培养基，阳性对照组加入含可的松和阳性物pf-915275的细胞培养基，样品组加入含可的松和给药浓度待测样品的细胞培养基，继续培养；

13、待培养结束后收集细胞上清液，分别检测皮质醇分泌水平。

14、可选的，所述建立细胞β-内啡肽分泌模型，包括：

15、取对数生长期的细胞进行培养；

16、设置阴性对照组、阳性对照组和样品组，其中，阴性对照组加入细胞培养基，阳性对照组加入含阳性物二丁酰camp钠盐的细胞培养基，样品组加入含给药浓度待测样品的细胞培养基，继续培养；

17、待培养结束后收集细胞上清液，分别检测β-内啡肽分泌水平。

18、可选的，所述建立辣椒碱刺激细胞trpv1模型，包括：

19、取对数生长期的细胞进行培养；

20、对细胞装载荧光探针；

21、分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和样品组，其中，阴性对照组、阳性对照组和样品组采用辣椒碱激活细胞trpv1通道引发钙离子内流，空白对照组加入平衡盐缓冲液，阴性对照组加入含辣椒碱的平衡盐缓冲液，阳性对照组加入含辣椒碱和阳性物辣椒平的平衡盐缓冲液，样品组加入含辣椒碱和给药浓度待测样品的平衡盐缓冲液，孵育；

22、待孵育结束后，分别检测细胞钙离子内流水平。

23、可选的，所述待测样品为水溶性样品时，直接溶于培养基进行后续实验；

24、所述待测样品为油溶性样品时，采用二甲基亚砜助溶后加入培养基进行后续实验，所述待测样品在培养基中不能形成沉淀而干扰检测；

25、使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不超过培养终体积的1％。

26、可选的，所述取对数生长期的细胞进行培养，包括：采用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全培养基培养，培养条件为37±0.5℃，(5±1)％co2浓度，饱和湿度；

27、将培养得到的细胞以(1.0-2.0)×105cells/ml的密度接种于96孔板中，每孔培养基100ul，每组设3个或3个以上复孔。

28、可选的，所述对细胞装载荧光探针包括：采用平衡盐缓冲液清洗细胞2-3次，将细胞在含钙离子探针的细胞培养基中孵育，孵育结束后再用平衡盐缓冲液清洗2-3次，所述平衡盐缓冲液包括含ca2+的hanks平衡盐溶液。

29、可选的，所述皮质醇分泌水平采用elisa试剂盒检测，以皮质醇相对含量进行表示；

30、所述可的松诱导细胞皮质醇分泌模型需满足阴性对照组的皮质醇相对含量比空白对照组的皮质醇相对含量高10％或10％以上，阳性对照组的皮质醇相对含量比阴性对照组的皮质醇相对含量低10％或10％以上。

31、可选的，所述β-内啡肽分泌水平采用elisa试剂盒检测，以β-内啡肽相对含量进行表示；

32、所述细胞β-内啡肽分泌模型需满足阳性对照组的β-内啡肽相对含量比阴性对照组的β-内啡肽相对含量高10％或10％以上。

33、可选的，所述细胞钙离子内流水平采用fluo-3am探针染色后在荧光酶标仪上机检测，以相对荧光强度进行表示；

34、所述辣椒碱刺激细胞trpv1模型需满足阴性对照组的相对荧光强度比空白对照组的相对荧光强度高10％或10％以上，阳性对照组的相对荧光强度比阴性对照组的相对荧光强度低10％或10％以上。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

36、神经美容这一概念的提出促进了人们对皮肤的认识，有益于更精准有效的护肤，但目前国内外相关的研究报道较少，更多局限于市场的宣传，而缺乏系统的评价方法。与现有技术相比，本发明填补了化妆品原料神经美容功效体外实验室评价方法的空缺，创新性地结合神经美容的不同作用途径，提供一种系统评估化妆品原料及成品神经美容功效的体外方法。针对神经美容的不同作用机制，分别构建了评估对抗皮肤压力和缓解神经敏感作用的三种细胞模型。通过对测试结果进行综合分析来系统评价目标原料及成品的神经美容活性，属于系统型评估方法，具有操作简易、全面、快速高效、准确的技术优势，可为神经美容化妆品的研发、复配和筛选提供依据。