一种雌二醇地屈孕酮片有关物质的分析方法与流程

本发明涉及一种雌二醇地屈孕酮片有关物质的分析方法。

背景技术：

1、雌二醇（estradiol），化学名：雌甾-1,3,5（10）-三烯-3,17β-二醇，化学结构：

2、

3、地屈孕酮（dydrogesterone），化学名：9β,10α-孕烷-4,6-二烯-3,20-二酮，化学结构：

4、

5、雌二醇是一种人工合成的雌激素，可以替代更年期妇女雌激素减少，减轻更年期的症状。

6、地屈孕酮是具有口服活性的孕激素。因雌激素促进子宫内膜的生长，雌激素水平升高将会增加子宫内膜增生和癌症的风险。添加孕激素可大大降低未切除子宫的妇女雌激素诱导的子宫内膜增生的风险。雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片复合包装采用雌孕激素联用，提高了围绝经期综合征治疗的用药安全性，对提高临床疗效具有积极作用。

7、由于雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片复合包装包括两种片剂，雌二醇片及雌二醇地屈孕酮片，其中雌二醇和地屈孕酮从原料药合成到制剂工艺过程中有可能残留起始物料、中间体及反应副产物等，在贮藏过程中还有可能产生降解产物。因此建立一个有效的雌二醇地屈孕酮片有关物质分析方法，快速准确实现雌二醇地屈孕酮片有关物质的测定，在合成和制剂过程的质量控制方面具有重要的现实意义。

8、在进口药品注册标准jx20130310中披露了雌二醇4个有关物质，如下表1所示；进口药品注册标准jx20130310中披露了地屈孕酮2个有关物质（6-去氢孕酮和17α-地屈孕酮），此外欧洲药典11.0中还披露了地屈孕酮杂质a，各杂质详细信息如表2所示。

9、表1：雌二醇已披露的有关物质

10、。

11、表2：地屈孕酮已披露的有关物质

12、。

13、然而，在进口注册标准进行重现后我们发现其中17α-雌二醇与雌二醇分离度不佳；地屈孕酮杂质a与地屈孕酮完全重合，6-去氢孕酮与17α-地屈孕酮完全重合，对于雌二醇和地屈孕酮，均存在主峰与相邻杂质分离不佳以及地屈孕酮特定杂质完全重合的情况，因此需要对测定条件进行探索改进；同时建立一套适用于雌二醇、地屈孕酮原料及相关单方和复方制剂有关物质分析方法，用于原料药、中间产品和成品的质量控制。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供一种利用高效液相色谱分析雌二醇地屈孕酮片有关物质的方法，该方法可以使雌二醇地屈孕酮片工艺及降解杂质（详见上表1、2）有效分离，并且操作简单，雌二醇地屈孕酮片的多个杂质及原料药中的数个工艺杂质（ep中登载）均可有效检出，灵敏度高，专属性强。

2、本发明通过以下方案解决上述技术问题。

3、本发明提供了一种雌二醇和/或地屈孕酮的检测分离方法，其包括如下步骤：

4、采用液相色谱法对待测样品进行检测或分离；所述待测样品包括物质1和/或物质2，所述物质1为雌二醇和杂质1，所述杂质1选自17α-雌二醇、雌酮、δ9,11-雌二醇和6-酮-雌二醇中的一种或多种，所述物质2为地屈孕酮和杂质2，所述杂质2选自地屈孕酮杂质a、6-去氢孕酮和17α-地屈孕酮中的一种或多种；

5、其中，所述液相色谱法的检测条件包括：

6、色谱柱为十八烷基键合硅胶反相色谱柱；

7、流动相a为水；

8、流动相b为乙腈-甲醇；

9、流动相c为乙醇；

10、所述流动相b中，所述乙腈和所述甲醇的体积比为1:1；

11、所述液相色谱法的洗脱方式为线性梯度洗脱，洗脱程序如下：

12、；

13、其中，x1为62-64%；x2为50-52%；y1为36-38%；y2为10%；y3为35%；表格中例如“0→15分钟，流动相a的体积为x1”是指：在0-15分钟范围内，流动相a (流动相a体积占流动相总体积的百分数)固定为x1；“15→20分钟，流动相b的体积为y1→y2”是指在15-20分钟范围内，流动相b(流动相b体积占流动相总体积的百分数)从y1线性变化至y2。

14、在本发明的一些实施方案中，所述杂质1选自17α-雌二醇、雌酮和6-酮-雌二醇中的一种或多种。

15、在本发明的一些实施方案中，所述色谱柱种类为chromcore 120 c18或thermohypersil ods；优选地，所述色谱柱为chromcore 120 c18 4.6*150mm，5μm或thermohypersil ods，150×4.6mm，3μm。

16、在本发明的一些实施方案中，所述色谱柱的填料粒度可为2.5-7.5μm，例如5μm或3μm。

17、在本发明的一些实施方案中，所述色谱柱的长度可为100-200mm，优选150mm。

18、在本发明的一些实施方案中，所述色谱柱的内径可为3-5mm，优选4.6mm。

19、在本发明的一些实施方案中，所述线性梯度洗脱的洗脱程序为：

20、

21、或，

22、。

23、在本发明的一些实施方案中，在进行检测前，对所述待测样品进行预处理，以符合进样标准，所述的预处理为本领域常规的预处理，具体包括：将所述待测样品溶解于稀释剂中；所述稀释剂可为乙腈和水的混合溶液；所述乙腈和水的体积比优选为40:60；所述待测样品中每一物质与所述稀释剂的质量体积比可为0.01~500 μg/ml；优选为0.1~500μg/ml；例如0.13μg/ml、0.15μg/ml、0.3μg/ml、0.5μg/ml、100μg/ml或500μg/ml。优选地，在溶解步骤后，进一步包括过滤步骤，例如采用聚四氟乙烯微孔滤膜进行过滤。

24、在本发明的一些实施方案中，所述色谱柱的柱温可为35-45℃，优选为40℃。

25、在本发明的一些实施方案中，所述检测分离方法的检测器可为紫外检测器；当所述待测样品中含物质1时，所述检测器的检测波长可为220nm；当所述待测样品中含物质2时，所述检测器的检测波长可为310nm。

26、在本发明的一些实施方案中，所述流动相的流速可参考本领域色谱法检测时的常规流速，例如0.8-1.2 ml/min，优选为1.0 ml/min。

27、在本发明的一些实施方案中，所述液相色谱法的进样量可参考本领域色谱法检测分析的常规进样量，例如20-80 μl，优选为50 μl。

28、在本发明的一些实施方案中，所述待测样品包含地屈孕酮和地屈孕酮杂质a。

29、在本发明的一些实施方案中，所述待测样品包含雌二醇和17α-雌二醇。

30、在本发明的一些实施方案中，所述待测样品还可包含6-去氢孕酮和17α-地屈孕酮。

31、在本发明的一些实施方案中，所述待测样品由17α-雌二醇、雌酮、雌二醇、6-酮-雌二醇、地屈孕酮、地屈孕酮杂质a、6-去氢孕酮和17α-地屈孕酮组成。

32、在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

33、本发明所用试剂和原料均市售可得。

34、本发明的积极进步效果在于：

35、本发明所述的方法适用于雌二醇、地屈孕酮及相关单方与复方制剂杂质的分离和测定，可用于单独检测某一种物质，也可同时分离和检测雌二醇、地屈孕酮及其相关杂质。与现有技术相比，本发明的检测分离方法对雌二醇及相关杂质、地屈孕酮及相关杂质的分离效果更佳，该方法专属性强，灵敏度更高，准确度好，且片剂辅料不干扰检测，可以更好地控制雌二醇地屈孕酮片的质量，具有显著的进步性。