一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法及应用

本发明属于中药质量分析与控制，具体涉及一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法及应用。

背景技术：

1、茯苓系多孔菌科真菌茯苓wolfiporia hoelen(fr.)y.c.dai&v.papp的干燥菌核，主产于四川、安徽、云南、湖南、湖北等地，多于秋季采挖，有利水渗湿、健脾和胃、宁心安神的功效，临床上用于治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻等症状。茯苓的主要活性成分为茯苓三萜类和茯苓多糖类化合物。目前，从茯苓中分离出的三萜类化合物高达100多种，茯苓三萜亦被证实有健脾、利尿、抗炎、抗肿瘤等药理作用。

2、中药多成分、多功效的作用特点使得单一成分的含量测定难以评价药材质量的优劣，即由于中药成分的复杂性，单一成分的测定并不能全面反映药材质量；因此，基于多成分、多指标分析的含量测定方法已经成为当前普遍认可的质量评价方式。相关技术中公开了一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法及其应用，其通过液相色谱法进行检测，选用茯苓酸为参照物，建立了同时测定茯苓中茯苓新酸b、去氢土莫酸、茯苓新酸a、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸含量的一测多评方法。可见，相关技术中的方法可检测的三萜酸类化合物较为有限，并不能全面反应药材质量。且中国药典中也暂无茯苓[含量测定]项控制标准。

3、因此，需要建立一种同时测定茯苓中更多种茯苓三萜酸含量的测定方法，用于检测茯苓中主要的茯苓三萜类成分，为茯苓药材的质量控制提供依据。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，该方法实现了茯苓中主要的13种三萜酸类化合物的同时测定，且测定成本低、测定效率高。

2、本发明还提供了上述测定方法在茯苓及其衍生产品质量控制中的应用。

3、本发明的一个方面，提供了一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，包括采用液相色谱法对茯苓供试品溶液进行检测；

4、其中，所述三萜酸类化合物包括6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸；

5、所述液相色谱法的检测条件包括：

6、流动相a：质量分数为0.05％～0.4％的磷酸水溶液；

7、流动相b：乙腈；

8、洗脱方式：梯度洗脱；

9、所述梯度洗脱的过程为：

10、0min～20min，流动相b的体积分数由48％～52％升高至52％～55％；

11、20min～39min，流动相b的体积分数保持为52％～55％；

12、39min～43min，流动相b的体积分数由52％～55％升高至60％～64％；

13、43min～47min，流动相b的体积分数保持为60％～64％；

14、47min～70min，流动相b的体积分数由60％～64％升高至90％～94％；

15、70min～80min，流动相b的体积分数保持为90％～94％。

16、根据本发明的一些实施方式，所述供试品溶液由以下步骤制备得到：将茯苓样品与甲醇混合后，固液分离，收集滤液，即得。

17、根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品和甲醇的质量体积比为1g：20ml～30ml。

18、经上述方法处理所得样品可直接用于hplc分析，目标成分含量均在线性范围内。

19、本发明采用甲醇为提取剂，实现了茯苓样品中三萜酸类化合物的高效提取。

20、根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括天然的茯苓样品和人工培育/发酵得到的茯苓样品。根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括茯苓皮及其衍生产品、赤茯苓及其衍生产品、白茯苓及其衍生产品、茯神及其衍生产品。根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括茯苓菌发酵培养所得产品。

21、根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品的粒径为过40-100目筛。

22、根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品与甲醇混合后，经超声处理后再固液分离；其中，所述超声处理的功率为200w～250w，所述超声处理的频率为38khz～42khz，所述超声处理的时间为30min～40min。

23、根据本发明的一些实施方式，所述固液分离的方法为微孔滤膜过滤。其中，所述微孔滤膜的孔径为0.2μm～0.25μm。

24、根据本发明的一些实施方式，当所述茯苓样品为茯苓皮和/或赤茯苓时，所述供试品溶液由以下步骤制备得到：

25、将所述茯苓样品粉碎后过40～100目筛，过筛后与甲醇混合，超声处理后，采用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。

26、根据本发明的一些实施方式，当所述茯苓样品为白茯苓和/或茯神时，所述供试品溶液由以下步骤制备得到：

27、将所述茯苓样品粉碎后过40～100目筛，过筛后与甲醇混合，超声处理后，旋蒸后再次溶解，采用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。

28、根据本发明的一些实施方式，所述流动相a为质量分数为0.2％～0.4％的磷酸水溶液。

29、根据本发明的一些实施方式，所述梯度洗脱的过程为：

30、0min～20min，流动相b的体积分数由50％升高至53％；

31、20min～39min，流动相b的体积分数保持为53％；

32、39min～43min，流动相b的体积分数由53％升高至62％；

33、43min～47min，流动相b的体积分数保持为62％；

34、47min～70min，流动相b的体积分数由62％升高至92％；

35、70min～80min，流动相b的体积分数保持为92％。

36、采用上述梯度洗脱程序，兼顾保证检测到供试品溶液中的理化性质和极性差异较大的多种成分并保证各峰之间的分离度，以确保成分含量的准确性和待检测成分的全面性。

37、根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的检测条件包括采用变波长程序检测：

38、0min～35min，检测波长为240nm～245nm；

39、35min～42min，检测波长为200nm～205nm；

40、42min～65min，检测波长为240nm～245nm；

41、65min～67min，检测波长为200nm～205nm；

42、67min～76min，检测波长为240nm～245nm；

43、76min～78min，检测波长为200nm～205nm；

44、78min～80min，检测波长为240nm～245nm。

45、在上述区间的公共点，则为转换波长的时刻。例如，在35min将检测波长从240nm～245nm调整为200nm～205nm；依此类推。

46、根据本发明的一些优选的实施方式，所述变波长程序为：

47、0min～35min，检测波长为242nm；

48、35min～42min，检测波长为203nm；

49、42min～65min，检测波长为242nm；

50、65min～67min，检测波长为203nm；

51、67min～76min，检测波长为242nm；

52、76min～78min，检测波长为203nm；

53、78min～80min，检测波长为242nm。

54、本发明采用变波长检测程序使得仪器波长设置在待检成分的最大吸收波长附近，提高信号灵敏度，并减少干扰；还能同时检测多种物质，使谱图更加完整美观。

55、在上述区间的公共点，则为转换波长的时刻。例如，在35min将检测波长从242nm调整为203nm；依此类推。

56、根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；优选地，所述色谱柱为agilent xdb-c18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm。

57、本发明采用agilent xdb-c18色谱柱，能够提高供试品溶液中三萜酸化合物的分离度。

58、根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的柱温为20℃～30℃。

59、根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的流动相b的流速为0.8ml/min～1.2ml/min。

60、根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的进样量为1μl～50μl。

61、柱温、体积流量等都会影响各茯苓三萜酸的出峰时间，在本发明温度和体积流量条件下得到的hplc色谱图上各待测成分色谱峰分离度较好，基线平稳。

62、根据本发明的一些实施方式，采用外标法或一测多评法对所述茯苓供试品溶液中的三萜酸类化合物的含量进行测算。

63、根据本发明的一些实施方式，采用一测多评法进行测算时，还包括：采用所述液相色谱法对含内参物的对照品溶液进行检测，根据检测结果计算所述茯苓供试品溶液中内参物的含量；根据相对校正因子计算所述茯苓供试品溶液中三萜酸类化合物的含量；

64、其中，所述内参物包括6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸中的任一种。

65、根据本发明的一些实施方式，以所述茯苓酸为内参物，计算供试品溶液中6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的含量；

66、计算公式如下：

67、wm＝wk×am/(ak×fkm)；

68、其中，ak为内参物峰面积；wk为内参物质量，单位为mg或μg；am为目标物m的峰面积，wm为目标物m的质量，单位为mg或μg；fkm为校正因子。

69、根据本发明的一些实施方式，所述相对校正因子由以下方式计算得到：

70、采用所述高效液相色谱法对6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的混合对照品溶液进行检测，根据检测结果分别计算6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的相对校正因子，计算公式如下；

71、相对校正因子f＝fi/fs＝(ai/wi)/(as/ws)；

72、其中，as代表内参物对照品的色谱峰面积，ws代表内参物对照品的质量浓度；ai代表待测物对照品的色谱峰面积，wi代表待测物对照品的质量浓度。

73、根据本发明的一些实施方式，所述混合对照品溶液中，各对照品的浓度为0.01～1mg·ml-1。

74、根据本发明的一些实施方式，所述混合对照品溶液的溶剂为甲醇。

75、根据本发明的一些实施方式，以茯苓酸作为内参物，所述6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的相对校正因子分别为0.43～0.47、1.30～1.41、3.87～4.04、0.91～0.96、2.46～2.65、0.87～0.92、3.92～4.15、0.36～0.40、2.62～2.68、1.49～1.59、1.43～1.48和0.58～0.64。本发明通过将相对校正因子控制在上述范围，实现了对6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的有效检测。

76、根据本发明的一些实施方式，采用所述液相色谱法对茯苓供试品溶液进行检测，得到6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的相对保留时间分别为0.17～0.19、0.41～0.43、0.48～0.50、0.54～0.56、0.57～0.60、0.71～0.72、0.73～0.75、0.77～0.78、0.97～0.98、1.00、1.07～1.09、1.12～1.14、1.15～1.18。

77、本发明通过将相对保留时间控制在上述范围，实现了对6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的有效分离和检测。

78、本发明的第二方面，提供上述测定方法在茯苓及其衍生产品质量控制中的应用。

79、根据本发明的一些实施方式，所述衍生产品包括茯苓膏、茯苓饼干、茯苓酥中的至少一种。

80、有益效果：

81、本发明通过调整色谱柱、梯度洗脱程序、变波长检测程序，实现了包括6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸在内的13种主要茯苓三萜酸的分离。再采用一测多评(qams)技术，选取相对易得的茯苓酸作为内参物，建立了内参物茯苓酸与其余12种待测三萜酸化合物6α-羟基猪苓酸c、茯苓新酸b、去氢土莫酸、土莫酸、茯苓新酸a、3-表去氢茯苓酸、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸、去氢齿孔酸、齿孔酸的相对校正因子，实现通过只测定茯苓酸的含量，用校正因子计算出另外12种三萜酸成分的含量。该方法灵敏、高效、准确，避免了多次检测操作，节约了检测成本和时间，为茯苓多成分质量控制提供参考，能够更加全面地反映药材质量。

82、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

83、术语与定义：

84、本文中“一测多评”(quantitative analysis by multiple componentssimultaneously，qams)法：是指利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，只测定一个成分(对照品可得到者)实现多个成分(对照品难以得到或难供应)的同步测定。不同浓度的标准品进样，以峰面积为值绘制成标准曲线，从而推算出未知试样中被测组分浓度的定量方法。

85、本文中“外标法”(external standard method，esm)：是指按梯度添加一定量的标准品(对照品)于空白溶剂中制成对照样品，与未知试样平行地进行样品处理并检测。