基于相量分析法的量子点编码微球的寿命设计和调控方法

本发明涉及微纳米材料制备领域，尤其涉及基于相量分析法的量子点编码微球的寿命设计和调控方法。

背景技术：

1、荧光寿命是时间维度的固有属性，测试稳定性好、抗背景干扰能力强，几乎不受能量转移和光漂白等因素的影响，因此成为生物成像和多路复用等领域的一种新的成像模式。但是，荧光寿命的测试一般需要对寿命数据进行长时间采集和分析。目前常见的寿命数据分析方法，都需要通过多次算法迭代，同时还受其他因素，例如仪器响应函数、荧光团的成分以及背景噪声等影响，从而无法精确设计和控制荧光寿命信号，尤其是多组分的多指数衰减，这阻碍了荧光寿命信号在生物分析尤其是多路复用中的实际应用。

2、相量分析法是一种将原始荧光寿命成像图的寿命信息简化的一种方法，能够将图像中每个像素点的衰减信号转换为相量图上的一个点。这种转换关系在相量图上呈现为一个以(g=0.5,s=0)为中心，半径为0.5的半圆曲线，被称为半圆规。在相量半圆规中，单指数衰减行为的像素点位于半圆上，多指数衰减行为的像素点位于半圆内部。具有相似荧光衰减特性的多个像素点,在相量图中位于相近的区域，形成“相量簇”，便于对数据进行可视化和聚类分析。相量图的一个重要特征是，多指数衰减过程对应的相量端点位于其各个单指数衰减组分对应的寿命相量端点连接组成的集合内，且与端点的距离与其贡献的强度成反比。这些特征在量化、可视化和聚类荧光寿命数据方面发挥着重要作用。

3、目前基于相量分析法对荧光寿命信号处理的方法主要集中于对于生物样品中的复杂荧光寿命信号解混分析。但是目前存在的问题是：缺乏一种直接、准确和可视化的寿命处理方法能够对已知寿命组合信号实现精确设计、预测和解析。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于相量分析法的量子点编码微球的寿命设计和调控方法

2、因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够对复杂寿命组合信号精确设计、预测和解析的方法，从而获得快速、灵活、简单、准确和直观的寿命解码方式，以便构建快速准确的液相生物芯片检测平台，为疾病的诊断提供强有力的工具。

3、本发明提供的技术方案如下：

4、<第一方面>

5、一种量子点聚合物微球的制备方法，包括如下步骤：

6、s1、将锌源和锰源按不同比例加在溶剂中形成混合溶液，脱气处理，升温后加入硒前驱体溶液，然后加入锌前驱体溶液，得到不同锰离子掺杂量的mn:znse核心溶液；

7、s2、将步骤s1得到的不同锰离子掺杂量的mn:znse核心溶液分别脱气处理，升温后分别加入锌/硫前驱体，保温一段时间，得到不同寿命的核壳量子点溶液；

8、s3、将不同寿命的核壳量子点溶液和聚合物溶液溶于有机溶剂中，形成分散相；将表面活性剂分散于水中，形成连续相；通过spg膜，形成水包油乳液，固化后得到不同寿命的量子点编码聚合物微球。

9、s1中，锌源和锰源的比例为40-53:1-3、10-15:1-3、4-8:1-3、1-5:1-3和1-3:1-3。

10、和/或，锌源包括氧化锌、醋酸锌、硬脂酸锌、乙酸锌和硫酸锌中的至少一种；

11、和/或，锰源包括氧化锰、硬脂酸锰、乙酸锰、二氯化锰中的至少一种；

12、和/或，混合溶液中锌源和锰源混合形成的混合溶液中锌源的浓度为0.01-0.03mol/l，锰源的浓度为0.0005-0.001 mol/l。

13、步骤s1包括如下步骤：

14、s11、制备锌前驱体：将锌源、油酸和十八烯混合，在保护气氛下，搅拌并升温至120-130℃进行抽真空处理，随后重新通入保护气氛并升温至280-300℃保温20-30min，再降至250-260℃得到锌前驱体溶液；

15、制备硒前驱体：将硒粉、十八烯和油胺混合，超声分散得到硒前驱体溶液；硒前驱体溶液浓度为0.01-0.03g/l；

16、s12、制备mn:znse核心量子点原液：将锌源、十八烯和不同量的锰源分别混合，在保护气氛下搅拌并升温至120-130℃进行抽真空处理，随后重新通入保护气氛并升温至280-300℃，注入硒前驱体，300-320℃保温5-10min后注入锌前驱体溶液，300-320℃保温5-10min，降温到75-85℃后得到不同锰离子掺杂量的mn:znse核心量子点原液；

17、s13、提纯mn:znse核心量子点：将步骤s12得到的核心量子点原液与正己烷混合，加入丙酮或无水乙醇沉淀量子点，离心收集沉淀物，并用正己烷和丙酮混合液多次洗涤，获得纯化后的不同锰离子掺杂量的mn:znse核心溶液。

18、步骤s11中，锌源包括氧化锌。

19、步骤s12中，锌源s11硬脂酸锌；锰源包括硬脂酸锰。

20、s2中，zn(oa)2-ot混合前驱体溶液通过以下方法制得：将锌源加在溶剂中脱气处理，升温至300-305oc后保温10-30min，降温至130-160oc后加入硫源。

21、s2中，zn(oa)2-ot混合前驱体溶液通过以下方法制得：将锌源加在溶剂中脱气处理，升温至300-305oc后保温10-30min，降温至130-160oc后加入硫源；

22、其中，硫源为正辛硫醇、硫代乙酰胺和硫粉中的至少一种；

23、和/或，锌源包括醋酸锌、硬脂酸锌、乙酸锌和硫酸锌中的至少一种；

24、和/或，锌源的浓度为0.01-0.03mol/l,锰源的浓度为0.0005-0.001mol/l；

25、和/或，溶剂为正十八烯和油酸的混合溶液，正十八烯与油酸的体积比为0.5-1.5:0.5-1.5。

26、作为本发明的一个实施方式，步骤s2包括如下步骤：

27、s21、制备zn(oa)2-ot混合前驱体溶液：将氧化锌、油酸和十八烯混合，在保护气氛下搅拌并升温至100-120℃进行抽真空处理，随后通入保护气氛并升温至300-320℃并保温10-20min，降温至120-150℃后注入正辛硫醇并120-150℃保温，制得zn(oa)2-ot前体溶液；

28、s22、制备mn:znse/zns核壳结构量子点：将步骤s1得到的不同锰离子掺杂量的mn:znse核心溶液溶于十八烯中，在保护气氛下升温至100-120℃进行抽真空处理，，随后通入保护气氛，升温至300-320℃进行zns壳层的生长，并向核心注入步骤s21的zn(oa)2-ot前体溶液，300-320℃保温30-60min后得到不同锰离子掺杂量的mn:znse/zns 核壳结构量子点溶液。

29、上述所述的保护气氛包括氮气、氩气等惰性气体。

30、步骤s3中，所述聚合物包括聚苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚苯乙烯、聚乳酸、苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙酸乙酯中的至少一种。

31、s3中，分散相中，聚合物的浓度为0.5-2g/ml。

32、s3中，所述mn:znse/zns核壳结构量子点量子点在分散相中的浓度为0-50 mg/ml。

33、s3中，有机溶剂包括甲苯、乙苯、三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙醚中的至少一种。

34、s3中，表面活性剂包括聚乙烯醇、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐、十二烷基硫酸钠中的一种。

35、s3中，连续相中，表面活性剂的浓度为0.001-0.01 g/ml。

36、<第二方面>

37、一种量子点编码微球的不同寿命组合信号调控方法，所述调控方法包括以下步骤：

38、将上述所述的不同寿命的量子点编码聚合物微球所对应的分散相按照不同比例组合，结合荧光寿命成像显微镜和相量分析法，通过层级调控，得到不同寿命信号组合编码的方法。

39、所述的不同寿命量子点溶液和聚合物混合的分散相在同一激发强度下的光子数一致，调整分散相中不同寿命量子点溶液的混合比例，根据半圆规中的矢量相加原理，对不同寿命量子点微球在半圆规的位置进行设计、预测和解析。

40、所述层级调控的方法包括如下步骤：

41、步骤1、不同寿命的核壳量子点溶液分别和聚合物溶液混合，在同一激发光激发下利用稀释液调节浓度，使其发射的光子数一致；

42、步骤2、光子数一致，寿命不同的分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得光子数一致寿命不同的微球悬浮液；将光子数一致寿命不同的微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，定义为量子一级寿命量子点编码微球；

43、步骤3、将两种不同的一级寿命量子点编码微球对应的分散相按照不同体积比混合形成分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得二级寿命编码微球悬浮液；将二级寿命编码微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，每个团簇代表不同的二级寿命信息；

44、步骤4、将一级寿命量子点编码微球对应的分散相和二级寿命编码微球对应的分散相按照不同体积比混合形成分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得三级寿命编码微球悬液；将三级寿命编码微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，每个团簇代表不同的三级寿命信息；

45、步骤5、选取至少两种不同级别的编码微球对应的分散相按照不同体积比混合，形成分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得多级寿命编码微球悬液；将三级寿命编码微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，每个团簇代表不同的多级寿命信息；

46、步骤6、通过相量图的各寿命团簇位置，对生物检测中的寿命信号进行分析和解码。

47、<第三方面>

48、如上所述的量子点编码微球的不同寿命组合信号调控方法在多因子检测中的应用。

49、<第四方面>

50、一种不同寿命量子点编码微球在肿瘤标志物检测中的应用。

51、<第五方面>

52、一种非疾病诊断目的肿瘤标志物检测方法，包括如下步骤：

53、步骤1、将不同寿命量子点编码微球分别和不同肿瘤标志物对应的捕获蛋白室温下共同孵育，在微球表面偶联所述的捕获蛋白（每种微球偶联一种蛋白）；

54、步骤2、偶联了捕获蛋白的微球加入至反应容器中，加入不同浓度的抗原标准溶液进行孵育，随后加入生物素化二抗溶液进行二次孵育，洗涤去除未结合的成分；

55、步骤3、步骤2的基础上，加入链霉亲和素-藻红蛋白（sape）进行孵育，洗涤缓冲液重悬混合物；

56、步骤4、将步骤3中得到的微球悬浮混合液滴加到具有微孔单元阵列的载体上，使微球嵌入微孔中，并通过共聚焦显微镜进行检测；

57、步骤5、在特定激发光下，检测不同微球的荧光强度，并通过相量分析法将荧光信息转化为寿命信息，实现对微球偶联的抗原的解码；

58、步骤6、对相量图中的不同寿命团簇进行圈门处理，并赋予不同伪彩颜色，生成相量成像图，用于定性判断不同肿瘤标志物；

59、步骤7、在另一激发光下，检测偶联在标志物上的藻红蛋白的荧光强度，基于藻红蛋白的荧光强度，并进行定量分析，实现不同标志物的定量检测。

60、步骤1中，不同寿命量子点编码微球具有可区分的荧光寿命特性。

61、不同寿命量子点编码微球包括一级寿命量子点编码微球、二级寿命量子点编码微球、三级寿命量子点编码微球或多级寿命量子点编码微球。

62、一级寿命信息量子点编码微球的制备方法包括如下步骤：

63、将上述的不同寿命的mn:znse/zns核壳量子点溶液分别和上述聚合物溶液混合，在同一激发光激发下利用稀释液调节浓度，使其发射的光子数一致；光子数一致，寿命不同的分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得光子数一致寿命不同的微球悬浮液；将光子数一致寿命不同的微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，定义为量子一级寿命量子点编码微球。

64、二级寿命量子点编码微球的制备方法如下：将两种不同的一级寿命量子点编码微球对应的分散相按照不同体积比混合形成分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得二级寿命编码微球悬浮液。将二级寿命编码微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，每个团簇代表不同的二级寿命信息。

65、三级寿命量子点编码微球的制备方法如下：将一级寿命量子点编码微球对应的分散相和二级寿命编码微球对应的分散相按照不同体积比混合形成分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得三级寿命编码微球悬液。将三级寿命编码微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，每个团簇代表不同的三级寿命信息。

66、多级寿命量子点编码微球的制备方法如下：选取至少两种不同级别的编码微球对应的分散相按照不同体积比混合，形成分散相溶液，通过spg膜乳化法，在连续相的作用下制备获得多级寿命编码微球悬液。将三级寿命编码微球悬浮液置于寿命成像显微镜下检测，收集寿命信号并转换为相量半圆规上的团簇，每个团簇代表不同的多级寿命信息。

67、步骤4中，所述微孔单元阵列的中心表面具有20x20的微孔单元，每个微孔单元由20个微孔组成，微孔间距为100 mm，每个微孔直径9 mm，深度3 mm。所述共聚焦显微镜的检测采用20×物镜和1000 hz激光，以确保对微球的高精度检测。

68、步骤5中、相量分析法包括将荧光成像数据转化为相量图中的寿命团簇，并通过团簇位置实现解码。

69、作为本发明的一个实施方式，所述肿瘤标志物包括乳腺癌的四种不同肿瘤标志物（cea、ca125、ca153和ca199）。

70、<第六方面>

71、一种用于实施上述所述检测方法的检测系统，包括：不同寿命的量子点编码聚合物微球、捕获蛋白、抗原标准溶液、生物素化二抗溶液、链霉亲和素-藻红蛋白（sape）、洗涤缓冲液、微孔单元阵列、共聚焦显微镜、以及数据处理与分析软件。

72、所述相量分析法可以直接将荧光强度成像图中每个像素点的寿命信息直接转换成为相量图中的一个点。

73、相量图为一个以g为横坐标，范围为0-1，s为纵坐标，范围为0-0.5的半圆规。

74、所述半圆规中的每个点代表一个对应的寿命信息，寿命从左到右呈递减的趋势，其中，（0,0）坐标代表寿命无限大，（0,1）坐标代表寿命无限小。

75、所述半圆规上的寿命信息遵循矢量相加法则

76、几何意义上,两种寿命混合材料对应的相量端点，应位于其各个寿命材料对应的寿命相量端 点的连线上，且与两端点的距离由两个组分的占比决定。

77、通过荧光寿命成像显微镜，可以对微孔中的微球成像，之后可以将寿命信息直接转化为相量图中的团簇信息，实现解码，同时对生物标记物上检测分子的荧光强度成像，实现对生物标记物的定量检测。

78、本发明的另一方面，提供了一种基于相量法的量子点编码微球寿命组合信号的设计、预测和调控方法，所述量子点寿命编码微球包括聚合物、不同寿命量子点荧光材料，所述荧光编码微球的粒径为1 μm-20 μm，通过层级编码，可以得到一共六级寿命调控编码策略。

79、根据本发明的又一方面，还提供了一种如上所述基于荧光寿命成像显微镜和相量分析法结合的荧光寿命分析方法，所述的方法可用于对不同寿命编码微球的组合寿命信号进行精确的设计、预测和解析。

80、该寿命调控方法制备过程简单、快速、解决了目前常复杂寿命信号的设计，控制和解析等问题。利用这种方法对蛋白、核酸等进行快速高通量的多元定量检测，可大幅提高检测的速度和直观性，在液相生物芯片检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。

81、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

82、1.本发明利用不同的方法制备得到不同种类的聚合物微球，通过改变微球中的量子点的寿命，制备出不同寿命量子点编码的微球。

83、2.本发明利用荧光寿命成像显微镜和相量分析技术，结合半圆规中的矢量相加法则，将不同寿命的量子点溶液按照比例混合，通过层级调控，实现对寿命组合信号的设计、预测和解析。

84、3.该方法是一种无拟合且可视的荧光寿命分析方法，比传统的拟合方法快得多。而且能将具有相似衰减特征的像素点以“相量簇”的形式呈现,具有强大的数据可视化功能, 也便于对数据进行聚类分析，为相关领域的研究提供有益的参考。

85、4.该方法在多元分析中可以实现快速直观的荧光寿命信号解码，通过相量图的策略对多组分的寿命信号快速解析，将推动寿命信号在多元检测中的实际应用。