一种新型脑组织透明化与免疫标记全器官成像方法

本发明涉及生物医学成像，具体涉及一种新型脑组织透明化与免疫标记全器官成像方法。

背景技术：

1、完整生物学样本的三维分析是揭示机体内重要结构与空间信息的关键技术，有助于研究全器官的组织环境内各类细胞间的相互关系，比如神经与血管结构呈空间网状，更需进行全器官的组织三维成像，然而，在目前的全器官的组织三维成像方法中，常采用细胞膜通透处理，抗体渗透缓慢，使得免疫染色周期时间长，使得全器官的组织透明与免疫染色技术费时费力，周期长，效率低，成本高，急需一种高效的全器官的组织三维成像方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型脑组织透明化与免疫标记全器官成像方法，能够提高标记效率，能够缩短全器官的组织三维成像周期，成本低。

2、本发明所采用的技术方案如下：一种新型脑组织透明化与免疫标记全器官成像方法，包括以下步骤：

3、s1：收集全器官样本；

4、s2：恢复全器官样本组织中抗原；

5、s3：消化全器官样本组织；

6、s4：封闭全器官样本组织；

7、s5：全器官样本组织一抗孵育，全器官样本组织中抗原与一抗特异性结合；

8、s6：全器官样本组织二抗孵育，全器官样本组织中一抗与二抗结合，一抗和二抗配合用于免疫标记；

9、s7：全器官样本脱水处理；

10、s8：全器官样本透明处理；

11、s9：用显微镜对全器官样本扫描，并处理获得被免疫标记的全器官样本组织三维图像。

12、解释说明：全器官是指一个完整的器官，全器官是由多种组织按照一定的次序结合在一起而形成的，在本发明中全器官指动物样本的大脑，某种组织中不同成分对应特定的抗原，抗原与抗体的结合，既可叫免疫结合，也可叫特异性结合，一抗是针对组织抗原的免疫球蛋白（也就是抗体），二抗为带有荧光基团的免疫球蛋白，微环境是指器官组织中不同成分。

13、技术方案的原理：

14、由于在收集全器官样本时，全器官样本被多种试剂浸泡过，全器官样本组织中抗原的抗原性下降，恢复抗原性，有利于后期有充分的抗原与一抗特异性结合，接着消化全器官样本组织，使得全器官样本组织由致密的结构变成多个微孔的结构，方便一抗快速渗透进入全器官样本组织深处，当需要对全器官样本中某一种组织三维成像时，准备跟该组织上特定的抗原特异性结合的一抗（也就是抗体），经过一抗孵育，全器官样本组织中抗原与一抗特异性结合，再通过二抗孵育，全器官样本组织中一抗与二抗结合，由于二抗为带有荧光基团的物质，当二抗与一抗结合后，也就是抗原间接带有荧光基团，也就是对抗原免疫标记染色，由于组织内的抗原间接结合了带有荧光基团的二抗，而被标记染色的抗原是某一种组织上的，这抗原被标记了，也就是对应组织被标记染色了，再经过脱水和透明处理后，显微镜扫描被免疫标记的全器官样本，全器官样本内的对应组织中的成分就会显像，获得全器官样本的组织三维图像。

15、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

16、1、本发明在一抗孵育前对全器官样本组织进行了恢复和消化处理，恢复全器官样本组织中抗原的抗原性，能够让原本存在全器官样本组织中的抗原均能与一抗结合，从而再通过二抗孵育把抗原标记出来，使得最终得到的组织三维图像完整，消化处理能够使得全器官样本组织由致密的结构变成多个微孔的结构，方便一抗快速渗透进入全器官样本组织深处，常规的采用细胞膜通透处理完成免疫标记的组织三维成像需要3～4周，本发明仅需3～4天就能够完成组织三维成像，使得抗原免疫染色周期时间短，抗原免疫标记效率高，能够缩短组织三维成像周期，人力成本降低；

17、2、本发明还能够同时进行多重免疫标记，由于不同的二抗上带有不同的荧光基团，不同的荧光基团具有不同的激发光波长，产生相应的显微镜下可见荧光，不同组织上的特定抗原分别与对应的一抗特异性结合，再经过二抗孵育，同时完成对不同组织中成分的免疫标记，提高组织三维成像效率，而且也使得组织三维成像更立体，同时对不同组织成分三维成像，实现完整器官组织微环境的三维可视化；

18、3、本发明也适用于多种器官组织，尤其适用于完整大脑的透明化处理，传统的大脑透明化处理需要进行脱脂处理，费时费力，且组织渗透性差，难以实现全器官的免疫标记，需要依赖内源性荧光的转基因动物样本，本发明通过脱水处理，能够方便、快速、高效实现全器官免疫标记，摆脱了对转基因动物的依赖。

19、作为本发明优选的实施方式，s1包括以下步骤：

20、s101：对动物全身麻醉；

21、s102：对动物心脏灌注磷酸盐缓冲液直至动物内脏由红变白；

22、s103：对动物灌注15-20ml的4%多聚甲醛；

23、s104：完整解剖分离全器官样本；

24、s105：用磷酸盐缓冲液淋洗全器官样本；

25、s106：收集全器官样本。

26、有益效果：经过磷酸盐缓冲灌注和淋洗全器官样本，能够充分冲洗掉样本表面的血液和毛发等异物，提高后期组织三维成像质量和清晰度，如果用漂白的方式来去除全器官样本中的血色素，比如使用强氧化剂或含有剧毒成分的漂白剂时，易对组织的内部结构造成损伤，比如细胞膜的破坏、蛋白质的变性，甚至组织的坏死，也就是易导致组织结构变化，使得在三维成像时产生伪影，导致成像结果不准确。

27、作为本发明优选的实施方式，s2包括以下步骤：

28、s201：以磷酸盐缓冲液为溶剂，以25%尿素，15%甘油，2%triton x-100、10% dmso为溶质配制第一混合溶液；

29、s202：在4摄氏度环境下，全器官样本在指定量的第一混合溶液中孵育6-12小时，恢复全器官样本组织中抗原。

30、有益效果：由于全器官样本在收集时经过试剂（比如磷酸盐缓冲液、多聚甲醛）的冲洗，全器官样本组织中抗原的抗原性就会下降，抗原性下降后，会导致后续抗原与抗体结合不稳定，特异性结合下降，使得组织三维成像结果不准确，对抗原恢复，能够去除残留的试剂（比如多聚甲醛）能够将全器官样本组织中的抗原保留下来，同时不被其他试剂破坏，保证抗原的完整性，确保后续三维成像结果准确；triton x-100还能够改善组织的渗透性。

31、作为本发明优选的实施方式，s3包括以下步骤：

32、s301：在37摄氏度环境下，用全器官样本体积5倍以上的胶原酶消化全器官样本组织半小时；

33、s302：用与胶原酶等量的0.5%胎牛血清终止消化全器官样本组织。

34、有益效果：胶原是组织的一个框架，胶原非常丰富的时候，组织结构非常致密，此时一抗直接进入组织深处是难以实现的，用胶原酶给全器官样本组织中的胶原消化后，组织中的胶原会下降，使得组织从致密的结构变成多个微孔的结构，从而提高组织的渗透性，方便后期抗体与抗原特异性结合时，抗体能够快速渗透进入组织深处，现有的通过细胞通透处理使得抗体进入组织深处，在细胞通透处理时需要几天时间，而且步骤较多，需要先清洗全器官样本，再通透处理，再清洗全器官样本；血清可中和胶原酶，停止消化全器官样本组织结构。

35、作为本发明优选的实施方式，s4包括以下步骤：

36、s401：以磷酸盐缓冲液为溶剂，以10%山羊血清、0.5%triton x-100、10%dmso为溶质配制第二混合溶液；

37、s402：在37摄氏度环境下，全器官样本放入指定量的第二混合溶液中浸泡半小时，封闭全器官样本组织中非特异性结合位点。

38、有益效果：封闭能够确保后续一抗与抗原特异性结合的准确性，减少一抗与除对应抗原之外的物质结合（也就是非特异性结合）。

39、作为本发明优选的实施方式，s5包括以下步骤：

40、s501：以磷酸盐缓冲液为溶剂，以2%山羊血清、10%dmso、0.5%triton x-100为溶质配制第一抗体缓冲液；

41、s502：将量为第一抗体缓冲液溶液量的1/200-1/300的一抗加入到第一抗体缓冲液中，得到一抗溶液；

42、s503：在37摄氏度环境下，全器官样本放入一抗溶液中孵育24小时，全器官样本组织中抗原与一抗特异性结合；

43、s504：以磷酸盐缓冲液为溶剂，以2%山羊血清、0.5%triton x-100为溶质配制第三混合溶液；

44、s505：在37摄氏度环境下，用第三混合溶液浸泡全器官样本3小时，每15分钟更换一次第三混合溶液。

45、有益效果：37摄氏度环境下孵育可有效加快抗体的渗透，促进抗原抗体的结合，在抗原与一抗特异性结合后，用triton x-100溶液清洗全器官样本，能够将多余的一抗清洗掉，防止后续二抗与游离的一抗结合后产生多余的标记，确保后续三维成像结果准确性。

46、作为本发明优选的实施方式，s6包括以下步骤：

47、s601：以磷酸盐缓冲液为溶剂，以2%山羊血清、10%dmso、0.5%triton x-100为溶质配制第二抗体缓冲液；

48、s602：将量为第二抗体缓冲液溶液量的1/500的二抗加入第二抗体缓冲液中，得到二抗溶液；

49、s603：在37摄氏度环境下，全器官样本放入二抗溶液中孵育12小时，全器官样本组织中一抗与二抗结合，一抗和二抗配合用于免疫标记；

50、s604：将量为第二抗体缓冲液溶液量的1/1000的dapi加入二抗溶液中，再对全器官样本孵育1-2小时；

51、s605：用0.5% triton x-100溶液浸泡全器官样本3小时，每15分钟更换一次0.5%triton x-100溶液。

52、有益效果：用triton x-100溶液清洗全器官样本，能够清洗掉多余的二抗，确保后续三维成像结果准确性。

53、作为本发明优选的实施方式，s7包括以下步骤：

54、s701：配制50%、80%和 100%的甲醇溶液；

55、s702：全器官样本依次放入样本体积10倍以上的50%的甲醇溶液、80%的甲醇溶液、100%的甲醇溶液各静置40分钟，对全器官样本脱水处理。

56、有益效果：由于后续全器官样本透明化处理选用的肉桂酸乙酯，肉桂酸乙酯具有油性，需把全器官样本中的水脱掉，肉桂酸乙酯才能够进入渗透到组织深处。防止脱水过快，引起的组织样本变形收缩等形态改变，梯度脱水可有效、缓慢、彻底地去除样本内的水分。

57、作为本发明优选的实施方式，s8包括以下步骤：

58、s801：准备样本体积10倍以上的肉桂酸乙酯；

59、s802：全器官样本放入肉桂酸乙酯中3小时，用于对全器官样本透明化处理。

60、有益效果：操作简单，仅需将全器官样本放入肉桂酸乙酯中就能完成透明化处理，而且采用肉桂酸乙酯对全器官样本透明化处理，所需时间短，相比现有的用二苄醚透明化处理，肉桂酸乙酯对实验人员而言更安全，对环境更友好。

61、作为本发明优选的实施方式，s9包括以下步骤：

62、s901：打开光片显微镜，避光环境下取出免疫标记且透明的全器官样本，用纸巾吸去样本表面多余的肉桂酸乙酯，用少量胶水将全器官样本固定于样本台上；

63、s902：将全器官样本置于显微镜的肉桂酸乙酯小池中，放置稳定后，打开计算机软件；

64、s903：调节物镜高度至显示出全器官样本图像，进行聚焦，调节激光强度；

65、s904：根据二抗的种类，选择对应的波长通道；

66、s905：按全器官样本大小及扫描精确度的需求，设置光片扫描的厚度；

67、s906：设置曝光时间；

68、s907：对全器官样本进行扫描，获取被免疫标记的全器官样本组织三维原始图像文件，并存储为tiff格式；

69、s908：三维原始图像文件导入imaris文件转换器中，经imaris文件转换器转换处理获得ims格式的全器官样本组织三维图像。