一种微流控电化学免疫传感器及其应用

本发明涉及生物传感器领域，具体涉及一种微流控电化学免疫传感器及其应用。

背景技术：

1、食物过敏是全球性的健康问题，调查研究发现约有8％的儿童和4％的成人对一种或多种食物有过敏症状。为了更好地预防和控制食物过敏的发生，食物致敏性风险评价成为食物过敏领域的研究热点。

2、目前各国及各国际组织对过敏蛋白的致敏性评价方法基本包括生物信息学、血清学筛选、消化稳定性、动物模型以及细胞免疫学模型等方法。由食物导致过敏的出现及其严重程度取决于嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面结合的与相应过敏原相互作用后导致颗粒中介质释放的程度和器官对这些介质的反应性，体外细胞模型介质释放实验的细胞免疫学方法可直接反映食物过敏原的致敏活性。

3、近年来，国内外报道了各种细胞体外致敏的生物标志物免疫分析技术，比如酶联免疫吸附法(elisa)、电化学发光法(ecl)、表面等离子体共振法(spr)、荧光法、电化学法等。相比于其他免疫分析技术需要专业操作和集中的实验室设备，电化学免疫传感器因其分析快速、灵敏度高、操作简单、成本低等优势而备受关注。而当前的电化学免疫传感器由于受到外部干扰会对结果造成影响，尤其是人为操作影响使得阻抗检测不稳定。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提出一种微流控电化学免疫传感器及其应用，以微流控芯片为基础，将具有优良电学特性的纳米材料金纳米颗粒在微流控芯片的电极表面构建金纳米电极，在此基础上制备高灵敏度和选择性好的电化学免疫微传感器，实现微流控芯片内的可控制备及其对食物过敏标志物的高灵敏度检测。

2、为了实现上述目的，本发明的实施例在第一方面提出了一种微流控电化学免疫传感器，其包括：

3、pdms芯片，所述pdms芯片内部设置有流道系统，所述流道系统包括多个进液流道，与多个所述进液流道一一对应连通的多个第一流道、入口与多个所述第一流道连通的过渡腔、与所述过渡腔的出口连通的第二流道、与所述第二流道连通的第三流道、与所述第三流道连通的出液流道；所述进液流道的进液口和所述出液流道的出液口均穿出pdms芯片上表面；所述过渡腔由其入口至其出口沿液体流动方向倾斜向下设置；所述第三流道具有呈s型弯曲的弯曲部，所述第三流道的底面敞开设置；

4、金纳米电极片，所述金纳米电极片可插入所述pdms芯片内并封闭所述第三流道的底面以形成反应检测区；所述金纳米电极片的工作电极表面依次修饰有十一巯基十一烷酸、n hs/edc、链霉亲和素和生物素标记的过敏标志物抗体；

5、应用时，将所述金纳米电极片连接电化学工作站。

6、根据本发明的微流控电化学免疫传感器，首先，pdms芯片从结构上设计了液体独立流道、倾斜的过渡腔以防回流，s型的可插入电极片流道，以及独立出口；独立流道设计允许同时进行多个实验，减少实验时间，提高效率，可以根据实验需要设计不同的流道布局，增加实验设计的灵活性；斜面设计可以有效防止液体在流动过程中产生回流现象，可以更加精确地控制液体流速和流量，进而控制反应时间和浓度梯度；s型流道设计增加了液体与电极的接触面积，提高了电化学反应的效率；可插入式电极片设计使得电极的更换和维护更加方便，适应不同的实验需求；其次，电化学免疫传感器集成在微流控芯片中，通过十一巯基十一烷酸、edc/nhs、链霉亲和素的包被使其能够耐流动，由于芯片的集成功能，避免了人工操作对实验结果造成的影响；微流控芯片的生物适配性很好，使得生物分子不会在芯片内失活而无法被检测到，可以保证检测的准确性；利用具有良好催化效果的金纳米粒子，实现信号放大；使用完全相同的纳米材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变食物过敏标志物种类即可实现不同食物过敏标志物的高灵敏、特异性检测，操作简单，检测速度快，可在短时间内实现大量样品的测定，有利于食物过敏标志物传感器的商品化；在检测抗体的标记物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了检测抗体标记物的制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。

7、可选地，还包括k3fe(cn)6溶液，所述k3fe(cn)6溶液为检测电解质，在待测样本从所述出液流道的出液口通入所述第三流道并孵育后，依次通入pbs和所述k3fe(cn)6溶液。由此，利用k3fe(cn)6作为电活性物质，将电子转移动力学转化为电极阻抗变化，实现了电化学信号的双重放大，进一步提高了传感器的灵敏度。

8、可选地，所述第三流道具有多个，各所述第三流道的底面均插设有一所述金纳米电极片。

9、进一步，所述第二流道的流出端为分叉流道，分叉流道的分叉数量与多个所述第三流道一一对应相通。

10、可选地，所述过渡腔的倾斜角度为30℃，所述第一流道所处的平面高于所述第二流道和所述第三流道。

11、可选地，所述金纳米电极片为三电极体系，包括工作电极、辅助电极和参比电极，所述工作电极上涂有金纳米粒子，所述参比电极为银/氯化银。

12、可选地，所述进液流道具有七个，七个进液流道分别用于进液pbs或乙醇溶液、硫酸溶液或k3fe(cn)6溶液、十一巯基十一烷酸、edc/nhs溶液、链霉亲和素、生物素标记的过敏标志物抗体以及封闭液。

13、本发明在第二方面提出了上述微流控电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

14、(1)制备所述pdms芯片：采用光刻的方法在石英玻璃片表面套刻出流道系统图形作为模具；然后将pdms浇铸到所述模具表面，固化成型后将pdms浇铸层从所述模具上取下，得到内部具有所述流道系统的pdms上层；再提供一平整的pdms下层；pdms上层与pdms下层通过等离子键合连接，并在所述金纳米电极片插入的位置留有空隙；

15、(2)制备所述金纳米电极片：提供三电极体系的电极片，电极片的基地材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、工作电极和辅助电极材料为碳，参比电极材料为银/氯化银；在所述工作电极表面滴涂6μl的金纳米粒子溶液，晾干，超纯水冲洗，晾干；

16、(3)将所述金纳米电极片插入所述pdms芯片预留的空隙，并通过夹具将所述pdms上层、所述金纳米电极片与所述pdms下层紧固，以获得微流控芯片；

17、(4)功能化所述微流控芯片：将pbs、硫酸、十一巯基十一烷酸、edc/nhs溶液、链霉亲和素、生物素标记的过敏标志物抗体、封闭液通过注射泵分别通入所述流道系统，以在所述金纳米电极片的工作电极表面依次修饰十一巯基十一烷酸、nhs/edc、链霉亲和素和生物素标记的过敏标志物抗体，获得微流控电化学免疫传感器。

18、本发明在第三方面提出了上述微流控电化学免疫传感器或上述制备方法制得的微流控电化学免疫传感器在过敏标志物检测领域的应用。

19、根据本发明的应用，微流控芯片的设计上采取了斜面防回流和特殊s型流道，可保证检测的准确性，减少芯片的系统误差。电化学传感器由金纳米电极为基地，依次在金纳米基地上沉积11-巯基十一烷酸、nhs/edc、链霉亲和素使其在微流控芯片上耐流动；接着可通入生物素标记的过敏标志物抗体，当通入含有生物标志物的样本，例如含抗原的样本并孵育，后依次通入pbs和k3fe(cn)6溶液。电子迁移动力学变化被电化学免疫传感器检测，并被转换成电极阻抗变化。通过阻抗大小可对过敏标志物进行检测。将微流控芯片与电化学传感器联用，耐流动的同时可达到特异性强、检测线低、灵敏度高、普适性强、再生性好等优点。后续可以与器官芯片联用，形成器官芯片-电化学传感器芯片-电化学工作站一个完整的检测系统；并对微流控芯片上电化学传感器的其他生物标志物检测提供了思路。

20、可选地，将所述微流控电化学免疫传感器连接电化学工作站，以循环伏安法对电极的修饰进行测试，初始电压为0v，高压0.6v，低压-0.6v，扫描速率为0.075，间隔取样0.001，灵敏度为10-0.004；以交流阻抗法对电极的修饰过程进行测试，高频100000，低频0.1，振幅0.05；每次测试前通入pbs清洗，并铁氰化钾作为电解质溶液；

21、待测样本从所述出液流道的出液口通入所述第三流道并孵育1h。

22、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。