一种十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法与流程

本发明涉及分析检测，尤其是涉及一种十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法。

背景技术：

1、十大功劳叶为小檗科植物阔叶十大功劳mahonia bealei(fort.)carr的的干燥叶。具有清虚热，燥湿，解毒之功效。临床常用于肺痨咳血，骨蒸潮热，头晕耳鸣，腰膝酸软，湿热黄疸，痢疾，目赤肿痛，痈肿疮疡，带下，风热感冒。小檗科的十大功劳叶(阔叶十大功劳叶)首载于《本草再新》，延用至今，为中医临床治疗肺痨、关节疼痛的常用药物。

2、现有的对十大功劳叶相关饮片及制剂的质量控制手段主要集中于水分、灰分、薄层鉴别、总黄酮及生物碱类成分的测定。中药指纹图谱、特征图谱技术可以整体、宏观地表征被测样品主要化学成分的特征，是目前公认的最适合中药及天然药物内在物质群质量控制的手段之一。

3、但是现有技术公开的十大功劳叶的特征图谱仅仅是针对药材的特征图谱，而饮片、标汤和颗粒却没有检测方法。中药成分复杂，多以汤剂入药，因此针对上述同时测定十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱的研发是非常必要的。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法，本发明构建的十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱方法稳定，可靠，可以对十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。

2、本发明提供了一种十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法，包括：

3、a)将十大功劳叶采用溶剂提取，得到待测液；

4、b)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到十大功劳叶原料的hplc特征图谱；

5、所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为c18柱；流动相a为乙腈，流动相b为0.2％磷酸-0.2％三乙胺，梯度洗脱；

6、所述梯度洗脱具体为：

7、0～3min，a相：12％→14％、b相：88％→86％；

8、3～19min，a相：14％→18％、b相：86％→82％；

9、19～28min，a相：18％→29％、b相：82％→71％；

10、28～48min，a相：29％→30％、b相：71％→70％；

11、48～55min，a相：30％→35％、b相：70％→65％。

12、本发明提供的一种十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法首先取十大功劳叶原料，溶剂提取，得到待测液。所述溶剂优选为盐酸-30％甲醇(1∶100)。

13、按照本发明，所述十大功劳叶原料为十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒。

14、按照本发明，十大功劳叶药材/饮片待测液制备具体为：将十大功劳叶采用盐酸-30％甲醇溶解，加热回流提取，放冷，摇匀，滤过，即得；

15、所述加热回流的时间为30min；其中盐酸-30％甲醇的体积比为1:100。

16、本发明提取溶剂为盐酸-30％甲醇(1∶100)，即100ml30％甲醇中加入1ml盐酸。

17、所述十大功劳叶原料的质量g和溶剂的体积ml的比为0.5：20～30；优选为0.5:25。

18、所述十大功劳叶标准汤剂制备具体为：将十大功劳叶采用盐酸-30％甲醇(1∶100)溶解，超声提取，放冷，摇匀，滤过，即得；所述超声功率为600w，频率为40khz；其中盐酸-30％甲醇的体积比为1:100；所述十大功劳叶原料的质量g和溶剂的体积ml的比为0.2：20～30；优选为0.2:25。

19、十大功劳叶配方颗粒制备具体为：将十大功劳叶采用盐酸-30％甲醇溶解，超声提取，放冷，摇匀，滤过，即得；所述超声功率为600w，频率为40khz；其中盐酸-30％甲醇的体积比为1:100。所述十大功劳叶原料的质量g和溶剂的体积ml的比为0.2：20～30；优选为0.2:25。

20、本发明采用上述盐酸-30％甲醇提取溶剂色谱峰信息量大，各个特征峰峰形好，分离度适中，提取效果好。同时，提取时间为30min效果好。

21、本发明所述十大功劳叶原料为十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂或十大功劳叶配方颗粒。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性检测。

22、本发明还包括制备对照品和对照药材参照物溶液：

23、分别取盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品，采用甲醇溶解，得到对照品参照物溶液。

24、一些具体实施例中，所述盐酸小檗碱对照品的浓度为60μg/ml；所述盐酸巴马汀对照品的浓度为20μg/ml；

25、取十大功劳叶对照药材采用盐酸-30％甲醇(1∶100)溶解，加热回流提取，放冷，过滤，得到对照药材参照物溶液；

26、将所述对照品和对照药材参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到对照品和对照药材参照物的色谱图；并根据对照品和对照药材参照物的色谱图对十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱的成分进行定性测定。

27、本发明流动相a为乙腈，流动相b为0.2％磷酸-0.2％三乙胺，梯度洗脱；本发明所述梯度洗脱优选具体为：

28、0所述梯度洗脱具体为：

29、0～3min，a相：12％→14％、b相：88％→86％；

30、3～19min，a相：14％→18％、b相：86％→82％；

31、19～28min，a相：18％→29％、b相：82％→71％；

32、28～48min，a相：29％→30％、b相：71％→70％；

33、48～55min，a相：30％→35％、b相：70％→65％。

34、本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。

35、所述色谱柱为c18柱，规格为5.0μm，4.6×250mm；柱温20℃。

36、本发明色谱柱在上述20℃条件下色谱峰对称、分离度好。

37、流动相流速优选为0.8ml/min。

38、本发明发现流速0.8ml/min下各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。

39、本发明检测波长优选为346nm。

40、本发明人发现，在346nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳。

41、本发明进样量优选为5μl。

42、本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以指纹图谱控制十大功劳叶十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的物质群，以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀指纹图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。

43、采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对十大功劳叶十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc标准特征图谱，其中峰5：盐酸巴马汀，峰6为盐酸小檗碱。

44、在所述十大功劳叶标准汤剂特征图谱中，以盐酸小檗碱为参照峰s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.15(峰1)、0.18(峰2)0.44(峰3)、0.66(峰4)。

45、质量判断标准：取十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒样品，按上述同法操作，得到十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。

46、采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。

47、本发明建立的十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒特征图谱以补骨脂素，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。

48、本发明新建的特征图谱方法，可以检测十大功劳叶及其标准汤剂中极性较大的成分。且供试品制备方法简单容易操作，指认特征峰相对较多。可对十大功劳叶及其制剂进行准确、可靠的特征图谱检测。对十大功劳叶及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。为有效控制和较全面评价十大功劳叶标准汤剂的质量提供依据。确保十大功劳叶及其标准汤剂质量的均一、稳定。

49、本发明提供了一种十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法，包括：a)将十大功劳叶采用溶剂提取，得到待测液；b)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到十大功劳叶原料的hplc特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为c18柱；流动相a为乙腈，流动相b为0.2％磷酸-0.2％三乙胺，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.2％磷酸-0.2％三乙胺为流动相进行梯度洗脱，以盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀为参照物，建立了十大功劳叶十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对十大功劳叶药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。