用于快速检测降钙素原的纳米探针、其制备方法及降钙素原的检测方法

本发明涉及医学与纳米材料领域，特别涉及一种用于快速检测降钙素原的纳米探针、其制备方法及降钙素原的检测方法。

背景技术：

1、抗菌药物合理应用是细菌感染性疾病治疗的核心。抗菌药物疗程过长是导致耐药的主要原因之一，合理的停药时机仍是临床面临巨大难题。实验诊断技术的快速发展，为抗菌药物合理应用提供了更多的参考依据。

2、降钙素原(pct)已被广泛应用于细菌感染性疾病诊断和治疗的重要参考指标，pct在下呼吸道感染和重症监护病房(icu)重症感染患者抗菌药物治疗疗程中的指导价值逐渐被认可。pct近年来被认为是一种机体对细菌感染的全身炎症反应的特异性指标，含有116个氨基酸。败血症是医院面临的日常挑战，死亡率高达50％。目前已知各种治疗策略可改善败血症患者的生存率。败血症的识别和治疗越早，预后越好。急性呼吸道感染是败血症的主要原因，约占全球发病率和死亡率的10％。正常生理状态下，pct只由甲状腺c细胞合成，在血浆内含量很少，在全身炎症反应和败血症的情况下，pct可由甲状腺以外组织大量产生，血浆内pct含量迅速升高。pct在血中的半衰期为25～30h，体内稳定性好，血清和血浆中的检测值无明显差异，对于细菌感染或脓毒症的早期诊断、提高诊断准确率、判断感染疾病严重程度和感染疾病预后评估等有较高的临床价值。近年来，传统的定量和半定量检测方法包括胶体金标志检验、放射免疫分析法、免疫荧光法、双抗体夹心免疫化学发光法、酶免法再pct检测中发挥重要作用，但它们存在一定的局限性，包括消耗时间长、检验灵敏度不够等。因此需要更加快速、准确的检测技术来弥补这些不足之处，为临床检测提供更高效的检测手段和保障。

3、时间分辨荧光共振能量转移(fret)法结合荧光纳米材料和修饰抗体形成双荧光探针，供体发射光谱与受体激发光谱有效重叠实现荧光能量转移延长反应时间便于观察，尤其是在高灵敏性的检测项目具有潜在的应用前景。它通过两种荧光纳米材料表面的官能团有效与识别抗体端偶联，根据“双抗体夹心法”形成“抗体-抗原-抗体”形成完整的免疫反应体系，快速实现供受体能量转移，实现对分子的高灵敏度检测。因此，采用抗体修饰的荧光纳米材料制备探针实现共振能量转移的fret法，为临床高灵敏度项目的快速检测提供了一种全新的方法和思路。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于快速检测降钙素原的纳米探针、其制备方法及降钙素原的检测方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种用于快速检测降钙素原的纳米探针的制备方法，该纳米探针包括供体探针b-cds-ab1和受体探针g-cds-ab2，该方法包括以下步骤：

3、s1、合成供体荧光纳米粒子b-cds：

4、s1-1、将柠檬酸粉末在磁力搅拌下溶解于纯化水中，直到溶液达到透明；随后，加入乙二胺形成均匀的混合溶液1；

5、s1-2、将混合溶液1加入到高压反应釜中，加热下反应，反应结束后冷却至室温，将所得产物溶液过滤，所得滤液与硅胶混合均匀后使用旋转蒸发仪进行蒸发，得到粗产品粉末1；

6、s1-3、采用色谱柱分离方法对粗产品粉末1进行提纯，采用甲醇和二氯甲烷的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱，将收集到的洗脱溶液与硅胶混合进行第二次自旋蒸发，最终得到供体荧光纳米粒子：b-cds，保存备用；

7、s2、合成受体荧光纳米粒子g-cds：

8、将西番莲提取物粉末和间苯二胺粉末在磁力搅拌下溶解于纯化水中，得到混合溶液2；

9、将混合溶液2加入到高压反应釜，加热下反应，反应结束后冷却至室温，所得产物溶液离心，将离心所得上清液与硅胶混合均匀后使用旋转蒸发仪进行蒸发，得到粗产品粉末2；

10、采用色谱柱分离方法对粗产品粉末2进行提纯，采用甲醇和二氯甲烷的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱，将收集到的洗脱溶液与硅胶混合进行第二次自旋蒸发，最终得到受体荧光纳米粒子：g-cds，保存备用；

11、s3、合成供体探针b-cds-ab1：

12、s3-1、取供体荧光纳米粒子b-cds溶解于pbs溶液中，过滤弃滤渣，得到b-cds溶液；

13、s3-2、将edc和nhs加入到b-cds溶液中，孵育，然后加入抗体1溶液，孵育；

14、其中，抗体1溶液为采用pbs配制的ab1溶液；

15、s3-3、取步骤s3-2得到的产物离心，弃上清液，得到b-cds-ab1浓缩液，加入pbs缓冲溶液重新离心洗涤去除未参与反应的edc、nhs和抗体1，得到供体探针：b-cds-ab1，保存备用；

16、s4、合成受体探针g-cds-ab2：

17、s4-1、取受体荧光纳米粒子g-cds溶解于pbs溶液中，过滤，弃滤渣，得到g-cds溶液；

18、s4-2、将edc和nhs加入到g-cds溶液中，孵育，然后加入抗体2溶液，孵育；

19、其中，抗体2溶液为采用pbs配制的ab2溶液；

20、s4-3、取步骤s4-2得到的产物离心，保留上清液，得到b-cds-ab1浓缩液，加入pbs缓冲溶液重新离心洗涤去除未参与反应的edc、nhs和抗体2，得到受体探针：g-cds-ab2，保存备用。

21、优选的是，步骤s1具体为：

22、s1-1、将0.5-2g柠檬酸粉末在磁力搅拌下溶解于5-30ml纯化水中，直到溶液达到透明；随后，加入150-600μl乙二胺形成均匀的混合溶液1；

23、s1-2、将混合溶液1加入到高压反应釜中，在160-200℃下反应3-12h，反应结束后冷却至室温，将所得产物溶液使用0.2-0.3μm的微孔膜过滤，所得滤液与1-4g硅胶混合均匀后使用旋转蒸发仪进行蒸发，得到粗产品粉末1；

24、s1-3、采用色谱柱分离方法对粗产品粉1末进行提纯，采用甲醇和二氯甲烷以体积比1：10组成的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱，将收集到的洗脱溶液与1-4g硅胶混合进行第二次自旋蒸发，最终得到供体荧光纳米粒子：b-cds，0-5℃下保存备用。

25、优选的是，步骤s2具体为：

26、s2、合成受体荧光纳米粒子g-cds：

27、将0.25-1g西番莲提取物粉末和0.4-1.6g间苯二胺粉末在磁力搅拌下溶解于15-60ml纯化水中，得到混合溶液2；

28、将混合溶液2加入到高压反应釜，140-180℃下反应4-16h，反应结束后冷却至室温，所得产物溶液在5000-20000rpm下离心15-60min，将离心所得上清液与1-4g硅胶混合均匀后使用旋转蒸发仪进行蒸发，得到粗产品粉末2；

29、采用色谱柱分离方法对粗产品粉1末进行提纯，采用甲醇和二氯甲烷以体积比1：10组成的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱，将收集到的洗脱溶液与1-4g硅胶混合进行第二次自旋蒸发，最终得到受体荧光纳米粒子：g-cds，0-5℃下保存备用。

30、优选的是，步骤s3具体为：

31、s3、合成供体探针b-cds-ab1：

32、s3-1、取0.05-0.2g供体荧光纳米粒子b-cds溶解于5-20ml 0.01m的pbs溶液中，使用0.2-0.3μm的微孔膜过滤，弃滤渣，得到b-cds溶液；

33、s3-2、将10-40mg edc和5-20mg nhs加入到0.5-2ml b-cds溶液中，室温下使用摇床摇匀孵育15-60min，然后向b-cds溶液中加入12.5-50μl抗体1溶液，室温下摇床孵育2-8小时；

34、其中，抗体1溶液为采用0.01m pbs配制的浓度为0.25-1mg/ml的ab1溶液；

35、s3-3、取150-600μl步骤s3-2得到的产物加入到超滤离心管中，5000-20000rpm下离心30-90min，保留上清液，得到b-cds-ab1浓缩液，加入150-600μl pbs缓冲溶液重新离心洗涤去除未参与反应的edc、nhs和抗体1，得到供体探针：b-cds-ab1，0-5℃下保存备用。

36、优选的是，步骤s4具体为：

37、s4、合成受体探针g-cds-ab2：

38、s4-1、取0.05-0.2g受体荧光纳米粒子g-cds溶解于5-20ml 0.01m pbs溶液中，使用0.2-0.3μm的微孔膜过滤，弃滤渣，得到g-cds溶液；

39、s4-2、将10-40mg edc和5-20mg nhs加入到0.5-2ml g-cds溶液中，室温下使用摇床摇匀孵育15-60min，然后向g-cds溶液中加入12.5-50μl抗体2溶液，0-5℃摇床孵育10-40小时；

40、其中，抗体2溶液为采用0.01m pbs配制的浓度为0.25-1mg/ml的ab2溶液；

41、s4-3、取150-600μl步骤s4-2得到的产物加入到超滤离心管中，5000-20000rpm下离心30-90min，保留上清液，得到b-cds-ab1浓缩液，加入150-600μl pbs缓冲溶液重新离心洗涤去除未参与反应的edc、nhs和抗体2，得到受体探针：g-cds-ab2，0-5℃下保存备用。

42、优选的是，所述的用于快速检测降钙素原的纳米探针的制备方法包括以下步骤：

43、s1、合成供体荧光纳米粒子b-cds：

44、s1-1、将1.051g柠檬酸粉末在磁力搅拌下溶解于15ml纯化水中，直到溶液达到透明；随后，加入335μl乙二胺形成均匀的混合溶液1；

45、s1-2、将混合溶液1加入到高压反应釜中，在180℃下反应6h，反应结束后冷却至室温，将所得产物溶液使用0.22μm的微孔膜过滤，所得滤液与2g硅胶混合均匀后使用旋转蒸发仪进行蒸发，得到粗产品粉末1；

46、s1-3、采用色谱柱分离方法对粗产品粉1末进行提纯，采用甲醇和二氯甲烷以体积比1：10组成的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱，将收集到的洗脱溶液与2g硅胶混合进行第二次自旋蒸发，最终得到供体荧光纳米粒子：b-cds，4℃下保存备用；

47、s2、合成受体荧光纳米粒子g-cds：

48、将0.5g西番莲提取物粉末和0.8g间苯二胺粉末在磁力搅拌下溶解于30ml纯化水中，得到混合溶液2；

49、将混合溶液2加入到高压反应釜，160℃下反应8h，反应结束后冷却至室温，所得产物溶液在10000rpm下离心30min，将离心所得上清液与2g硅胶混合均匀后使用旋转蒸发仪进行蒸发，得到粗产品粉末2；

50、采用色谱柱分离方法对粗产品粉1末进行提纯，采用甲醇和二氯甲烷以体积比1：10组成的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱，将收集到的洗脱溶液与2g硅胶混合进行第二次自旋蒸发，最终得到受体荧光纳米粒子：g-cds，4℃下保存备用；

51、s3、合成供体探针b-cds-ab1：

52、s3-1、取0.1g供体荧光纳米粒子b-cds溶解于10ml 0.01m pbs溶液中，使用0.22μm的微孔膜过滤，弃滤渣，得到b-cds溶液；

53、s3-2、将20mg edc和10mg nhs加入到1ml b-cds溶液中，室温下使用摇床摇匀孵育30min，然后向b-cds溶液中加入25μl抗体1溶液，室温下摇床孵育4小时；

54、其中，抗体1溶液为采用0.01m pbs配制的浓度为0.5mg/ml的ab1溶液，更优选的，ab1抗体为v0309，购自北京博奥森生物技术有限公司；

55、s3-3、取300μl步骤s3-2得到的产物加入到超滤离心管中，10000rpm下离心45min，保留上清液，得到b-cds-ab1浓缩液，加入300μl pbs缓冲溶液重新离心洗涤去除未参与反应的edc、nhs和抗体1，得到供体探针：b-cds-ab1，4℃下保存备用。

56、s4、合成受体探针g-cds-ab2：

57、s4-1、取0.1g受体荧光纳米粒子g-cds溶解于10ml 0.01m pbs溶液中，使用0.22μm的微孔膜过滤，弃滤渣，得到g-cds溶液；

58、s4-2、将20mg edc和10mg nhs加入到1ml g-cds溶液中，室温下使用摇床摇匀孵育30min，然后向g-cds溶液中加入25μl抗体2溶液，4℃摇床孵育20小时；

59、其中，抗体2溶液为采用0.01m pbs配制的浓度为0.5mg/ml的ab2溶液，更优选的，ab2抗体为v0306，购自北京博奥森生物技术有限公司；

60、s4-3、取300μl步骤s4-2得到的产物加入到超滤离心管中，10000rpm下离心45min，保留上清液，得到b-cds-ab1浓缩液，加入300μl pbs缓冲溶液重新离心洗涤去除未参与反应的edc、nhs和抗体2，得到受体探针：g-cds-ab2，4℃下保存备用。

61、本发明的第二方面，提供一种用于快速检测降钙素原的纳米探针，其特征在于，其通过如上所述的方法制备得到。

62、本发明的第三方面，提供一种快速检测降钙素原的方法，该方法采用如上所述的纳米探针进行检测，该方法为：

63、将供体探针、受体探针与含pct抗原的待测液混合，孵育，检测反应产物在激发光下、于450nm和505nm处的发射光的荧光强度，分别记为f450和f505，计算f505/f450的值，然后根据预先构建的表征pct抗原浓度与f505/f450的值之间关系的标准曲线计算得到待测液中的pct抗原浓度。

64、优选的是，所述的快速检测降钙素原的方法为：

65、将供体探针、受体探针与含pct抗原的待测液混合，37℃下孵育30min，检测反应产物在464nm的激发光下、在450nm和505nm处的发射光的荧光强度，分别记为f450和f505，计算f505/f450的值，然后根据预先构建的表征pct抗原浓度与f505/f450的值之间关系的标准曲线计算得到待测液中的pct抗原浓度。

66、优选的是，其中，标准曲线的构建方法包括以下步骤：

67、1)使用抗原抗体稀释液和pct抗原配制得到一系列含有不同pct抗原浓度的工作液；

68、2)将供体探针和受体探针加入到抗原抗体稀释液中，得到探针溶液，配制若干份等体积的探针溶液；

69、3)向每份探针溶液中加入相同体积、不同浓度的工作液，所得混合溶液在孵育，检测反应产物在激发光下、于450nm和505nm处的发射光的荧光强度，分别记为f450和f505，以pct抗原浓度为横坐标、f505/f450的值为纵坐标，拟合得到表征pct抗原浓度与f505/f450的值之间关系的标准曲线；

70、其中，抗原抗体稀释液为含bsa的pbs溶液。

71、优选的是，其中，标准曲线的构建方法包括以下步骤：

72、1)使用抗原抗体稀释液和pct抗原配制得到pct抗原浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、20、40、60、80ng/ml的工作液；

73、2)将20μl供体探针和20μl受体探针加入到180μl的抗原抗体稀释液中，得到探针溶液，配制若干份探针溶液；

74、3)向每份探针溶液中加入100μl不同浓度的工作液，所得混合溶液在37℃孵育30min，检测反应产物在464nm的激发光下、于450nm和505nm处的发射光的荧光强度，分别记为f450和f505，以pct抗原浓度为横坐标、f505/f450的值为纵坐标，拟合得到表征pct抗原浓度与f505/f450的值之间关系的标准曲线；

75、其中，抗原抗体稀释液为浓度0.01m的含3wt％bsa的pbs溶液。

76、本发明的有益效果是：

77、本发明提供了一种用于快速检测降钙素原的纳米探针、其制备方法以及基于该纳米探针的降钙素原检测方法，本发明通过设计制备抗体修饰的双探针，实现了降钙素原的高灵敏度特异性捕获识别，基于供、受体不同的荧光信号分子的体现，可以实现降钙素原的快速检测，从而为高敏感性的快速检测提供新工具。