基于中心切割二维液相色谱质谱联用的寡核苷酸药物杂质鉴定方法

本发明涉及寡核苷酸生化分析领域，具体为一种基于中心切割二维液相色谱质谱联用的寡核苷酸药物杂质鉴定方法。

背景技术：

1、寡核苷酸药物是一类由短链核苷酸组成的分子，用于靶向特定基因序列，具有广泛的治疗潜力。然而，由于其复杂的化学结构和合成工艺，在寡核苷酸药物的生产过程中可能会产生多种杂质，包括反应不完全或副反应产生的缺失、插入或突变序列，在储存或使用过程中由于物理化学条件引起的链断裂、脱氨、脱磷酸等降解产物，以及未完全耦合的核苷酸小分子，这些杂质的分析和控制对于药物的质量和安全性至关重要。而目前寡核苷酸药物的杂质分析存在以下挑战：

2、1)分子量差异小：杂质通常与主成分在结构上非常相似，分子量差异可能仅为一个核苷酸单元；

3、2)化学结构多样：杂质可能包括同分异构体、序列异构体及化学修饰等多种类型；

4、3)检测灵敏度要求高：寡核苷酸杂质的生物活性高，潜在生物毒性大，杂质的含量控制非常严格，要求分析方法具有极高的灵敏度。

5、为了有效分析寡核苷酸药物中的杂质，目前已有多种分析技术，其中高效液相色谱(hplc)可广泛用于寡核苷酸的纯度检测和杂质分析。结合质谱(ms)检测器，可以对寡核苷酸的杂质进行定性和测序分析。然而目前的液相色谱质谱联用方法通常首先采用亲水作用色谱(hilic)或反向离子对色谱(ir-rp)对寡核苷酸药物及杂质进行分离，其分离度有限且分析时间较长，通常在一个小时以上。而分离度较好的阴离子交换色谱法由于含有非挥发盐溶液而无法与质谱兼容。

技术实现思路

1、本发明针对现有寡核苷酸药物杂质分析方法匮乏的，提供了一种基于中心切割二维液相色谱质谱联用的寡核苷酸药物杂质鉴定方法。本发明方法首先采用阴离子交换色谱作为第一维色谱，对寡核苷酸药物及杂质进行初步分离，具有组分峰分离效果好、分辨率高、分析精度高、重现性好，分离快速等优点；进一步采用离子对反相色谱作为第二维色谱对目标样品或杂质进行进一步分离，具有能与质谱兼容的优点，通过质谱对寡核苷酸及药物进行分子量及序列进行鉴定，以达到对寡核苷酸质量进行有效控制的目的。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一、基于中心切割二维液相色谱质谱联用的寡核苷酸药物杂质鉴定方法

4、所述寡核苷酸药物杂质鉴定方法包括以下步骤：

5、1)获取待鉴定的样品溶液。所述待鉴定的样品溶液中包含至少一种目标产物，所述目标产物是长度为2～40mer的寡核苷酸，每种目标产物在所述待鉴定的样品溶液中的浓度为1～100pmol/μl。所述寡核苷酸样品的类型包括但不限于脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和dna-rna杂交体。所述寡核苷酸样品为反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，aso)、dsrna、sirna、核酸适配体或微rna。所述待鉴定的样品溶液采用depc处理水作为溶剂。

6、2)配制一维液相色谱柱的流动相ra和流动相rb，以及二维液相色谱柱的流动相la和流动相lb。

7、所述一维液相色谱柱的流动相ra采用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)缓冲液、n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)缓冲液或硼酸钠(bbs)缓冲液；所述一维液相色谱柱的流动相rb采用一维液相色谱柱的流动相ra与钠盐的混合溶液，所述钠盐为氯化钠(nacl)或者溴化钠(nabr)，优选为氯化钠，钠盐的浓度为0.4～1.5mol/l。

8、优选地，所述一维液相色谱柱的流动相ra为硼酸钠(bbs)缓冲液，所述硼酸钠缓冲液的浓度为1～25mmol/l，所述硼酸钠缓冲液的ph＝8.0～9.0，优选为ph＝8.0、8.5或9.0。所述一维液相色谱柱的流动相rb中，钠盐的浓度为1.0mol/l。

9、所述二维液相色谱柱的流动相la采用甲醇。所述二维液相色谱柱的流动相lb采用n,n-二异丙基乙胺和六氟异丙醇的混合水溶液，所述n,n-二异丙基乙胺在流动相lb中的浓度为20～50mmol/l，所述六氟异丙醇在流动相lb中的浓度为100～500mmol/l。

10、作为本发明的一种优选的技术方案，所述一维液相色谱柱的流动相ra为硼酸钠(bbs)缓冲液，浓度为20mmol/l、ph＝8.0；钠盐在一维液相色谱柱的流动相rb中的浓度为1.0mol/l。二维液相色谱柱的流动相la为甲醇，二维液相色谱柱的流动相lb中包含浓度为30mmol/l的二异丙基乙胺和浓度为200mmol/l的六氟异丙醇。

11、3)通过中心切割法利用一维液相色谱柱从待鉴定的样品溶液中分离得到目标组分。所述一维液相色谱柱的分离条件为：色谱流速0.5～0.8ml/min，进样体积1～10μl，柱温20～60℃，进样盘温度4～25℃。所述一维液相色谱柱的洗脱梯度为：

12、0min，63％流动相ra，37％流动相rb；

13、12min，35％流动相ra，65％流动相rb；

14、12.5min，20％流动相ra，80％流动相rb；

15、15min，20％流动相ra，80％流动相rb；

16、15.5min，63％流动相ra，37％流动相rb。

17、4)将目标组分注入二维液相色谱柱中，通过二维液相色谱柱对目标组分进一步分离并在线脱盐；所述二维液相色谱柱的分离条件为：色谱流速0.5～0.8ml/min，进样体积50～200μl，柱温20～60℃，进样盘温度4～25℃。二维液相色谱柱的洗脱梯度为：

18、0min，10％流动相la，90％流动相lb；

19、9min，10％流动相la，90％流动相lb；

20、12min，100％流动相la，0％流动相lb；

21、15.5min，100％流动相la，0％流动相lb。

22、5)使用质谱仪对目标产物的分子量和序列进行检测，得到目标产物的分子量和序列。所述步骤5)中，使用一级质谱测定目标产物的分子量，使用二级质谱(ms/ms)对目标产物进行碎片化处理以进行序列检测，所述碎片化处理的条件为：利用高能碰撞解离技术(hcd)，归一化碰撞能量(nce)为15％至35％，优选为30％，提取窗口为2da。

23、作为本发明的一种优选的技术方案，步骤5)采用的质谱仪型号为thermo fisherorbitrapexploris 120，质谱扫描范围为200～3000m/z，分辨率为60000，负离子模式，rflens 100％，离子源电压为2500v，sheath gas 60arb，aux gas15arb，sweep gas 2arb，离子传输管温度为350℃，蒸发温度为350℃。

24、作为本发明的一种优选的技术方案，一维及二维液相色谱柱的分离条件均为：色谱流速0.6ml/min；进样体积4μl；柱温40℃；进样盘温度4℃。

25、进一步地，所述步骤3)中，根据一维液相色谱柱的保留时间分别分离得到至少一份目标组分，每份目标组分对应至少一种目标产物，每份目标组分收集完成后，按照所述步骤4)～所述步骤5)将每份目标组分依次经过二维液相色谱柱分离和质谱仪检测后，得到目标组分中目标产物的分子量和序列。其中，每种目标组分对应至少一种目标产物是指：若一维分离不够，则在一个保留时间下目标产物没有分开，即一个保留时间下的目标组分对应不止一种目标产物，二维分离能够对目标组分进一步分离并在线脱盐。

26、优选地，所述一维液相色谱柱采用阴离子交换色谱柱；所述二维液相色谱柱采用c18色谱柱。

27、进一步地，所述一维液相色谱柱和二维液相色谱柱之间设置有紫外检测器和六通阀。所述紫外检测器用于检测目标产物在目标组分中的浓度，所述紫外检测器的检测波长设置为260nm；所述六通阀用于进行中心切割。

28、进一步地，所述六通阀内设有用于收集目标组分的定量环，所述定量环的容积为50μl或200μl，优选为50μl。

29、二、一种用于寡核苷酸药物杂质鉴定方法的中心切割二维液相色谱质谱联用系统

30、所述中心切割二维液相色谱质谱联用系统包括二元泵、进样器、一维液相色谱柱、紫外检测器、六通阀、二维液相色谱柱、三通阀和质谱仪。

31、所述二元泵的第一出口经进样器与一维液相色谱柱的入口连通，所述一维液相色谱柱的出口与紫外检测器的入口连接，所述紫外检测器的出口与六通阀的第三阀口连接，所述六通阀的第二阀口与外部的废液收集或处理装置的入口连接，所述六通阀的第一阀口、第四阀口分别与定量环的入口、出口连接，所述六通阀的第五阀口与二元泵的第二出口连接，所述六通阀的第六阀口与二维液相色谱柱的入口连接，所述二维液相色谱柱的出口与三通阀的三通入口连接，所述三通阀的三通第二出口与质谱仪的入口连接，所述三通阀的三通第一出口与外部的废液收集或处理装置的入口连接。

32、当六通阀的第三阀口与第二阀口连通，第五阀口、第四阀口、第一阀口与第六阀口依次连通时，所述六通阀用于将一维液相色谱柱的非目标组分切入废液，若定量环中存储有目标组分，所述六通阀还用于在二元泵的驱动下将目标组分注入二维液相色谱柱中；

33、当六通阀的第三阀口、第四阀口和第一阀口依次连通，第五阀口与第六阀口连通时，所述六通阀用于将一维液相色谱柱分离得到的目标组分收集在定量环中。

34、作为本发明的一种优选的技术方案，所述中心切割二维液相色谱质谱系统包括配有二元泵及紫外检测器的高效液相色谱仪thermo fisher scientific vanquish series、质谱thermo fisher orbitrap exploris 120。

35、作为本发明的一种优选的技术方案，所述一维液相色谱柱为thermo fisherscientific dnapactm pa200rs(填料粒径为4μm，色谱柱的直径×柱长为4.6×50mm)。所述二维液相色谱柱为thermo fisher scientific hypersil goldtm(填料粒径为3μm，色谱柱的直径×柱长为2.1×100mm)。

36、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

37、1、本发明分析方法覆盖的寡核苷酸序列范围宽，适用于各类序列和不同长度的寡核苷酸纯度检测。

38、2、本发明分析方法通过二维色谱在线脱盐，进而能够与质谱联用，快速分析样品纯度和分子量及序列。

39、3、本发明分析方法所采用的色谱方法分离时间短，分离度高。

40、4、本发明分析方法能够对寡核苷酸质量进行有效控制。