一种慢病毒滴度检测试剂盒以及检测方法与流程

本发明属于生物分析检测，尤其涉及一种慢病毒滴度检测试剂盒以及检测方法，适用于定量检测样品中hiv-1p24蛋白浓度。

背景技术：

1、在人体外，采用基因工程技术构建的修饰系统可有效地将遗传物质等转入特定目的细胞，用于修饰目的细胞的遗传物质、改变基因表达方式或调节细胞生物特性等。目前，慢病毒(lentivirus,lv)载体、γ逆转录病毒载体等常见用于将嵌合抗原受体(chimericantigen receptor,car)基因导入t细胞，以实现car-t细胞对肿瘤的靶向杀伤。慢病毒载体通过介导目的基因整合至细胞基因组发挥作用，慢病毒载体能感染有丝分裂活跃和不活跃的细胞。目前，体外基因修饰用慢病毒载体常见有人慢病毒、非人灵长类和非灵长类慢病毒等载体，其中基于人类免疫缺陷i型病毒(hiv-1)改造而来的慢病毒载体是最为常用的。慢病毒载体制备过程中的滴度检测对载体质量研究与控制起着重要作用。目前慢病毒滴度的检测方法主要有物理滴度、基因组滴度和转导滴度。慢病毒载体制备和临床使用的主要风险点包括：产生复制型慢病毒(replication competent lentivirus,rcl)，发生体内重组，以及在相关基因中或其附近插入前病毒dna从而可能引起或促进肿瘤发生和其他细胞病变等。

2、p24是hiv病毒颗粒的主要结构蛋白(病毒外壳中含量最大的标志性蛋白)，在病毒的包装和成熟过程中起到关键作用。p24蛋白具有高度保守的氨基酸序列，倘若p24缺失则会导致hiv病毒无法正常组装。研究表明，每个慢病毒大约含有2000个p24蛋白分子，1ng的p24相当于1.25×107个慢病毒物理颗粒。通过检测hiv-1p24蛋白含量，即可得出慢病毒物理滴度。

3、慢病毒滴度检测是确保慢病毒载体质量的关键步骤。通过精确计算慢病毒滴度，可以确保每次实验使用的病毒粒子数目一致，提高实验的可重复性。准确的慢病毒滴度，对于设计基因转导实验至关重要，合适的感染剂量可确保充分的基因表达而不引起过度的细胞损伤。

4、为了保证产品的安全性，目前基因治疗产品所用慢病毒载体均为非复制型，但由于载体系统各组分间或载体成分与细胞基因组间可能会发生同源或非同源重组导致复制型慢病毒(rcl)的产生。一旦产生复制型慢病毒(rcl)，就可能与细胞基因组发生整合，导致发生二次癌症的风险。针对该风险，国内外监管相关机构均要求建立复制型慢病毒(rcl)的检测方法，并在产品的生产及应用的不同阶段进行rcl的控制，以保证患者的用药安全。

5、慢病毒滴度(hiv-1p24)检测试剂盒适用于快速检测任何基于hiv-1的慢病毒的p24蛋白浓度测定，为慢病毒滴度检测、复制型慢病毒(rcl)检测提供了一种简单、快速的检测工具。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种慢病毒滴度检测试剂盒以及检测方法，该试剂盒适用于快速检测任何基于hiv-1的慢病毒的p24蛋白浓度测定，具有良好的线性、专属性、耐用性、精密度、准确度、检测限、钩状效应、稳定性，同时具有操作简便、检测周期短等优点。

2、为了实现上述目的，本技术采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种慢病毒滴度检测试剂盒，所述试剂盒包括捕获板和检测抗体溶液，

4、所述捕获板是通过包被hiv-1p24抗体，封闭液封闭后制备得到；

5、所述检测抗体溶液是通过生物素标记hiv-1p24抗体，得到生物素标记抗体，进而使用样品稀释液配制得到。

6、在以上技术方案中，所述捕获板的制备方法包括以下步骤：

7、s11，采用2#包被液将hiv-1p24抗体稀释成浓度为2μg/ml的包被液，按照100μl/孔均匀加入酶标板中，封口膜封口后放置于2～8℃孵育16～20小时；

8、s12，弃去所述酶标板中的包被液，洗板2次；

9、s13，加入2#封闭液，于25～37℃条件下封闭1～4小时；

10、s14，弃去所述酶标板中的2#封闭液，将所述酶标板放置于25～37℃条件下干燥1～4小时；

11、s15，干燥完成后，包被好的所述酶标板真空包装，即得所述捕获板。

12、在以上技术方案中，所述检测抗体溶液的制备方法为：

13、利用biotin-lc-lc-nhs可与伯氨基反应，形成稳定的、不可逆的酰胺键，从而达到对含有伯氨基的抗体进行标记的效果；

14、按照1mg抗体添加15μl的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液，于截留分子量为50kda的超滤管中进行标记，去除游离生物素，测定生物素标记物蛋白浓度，加入等体积标记物保护液，即得所述生物素标记抗体；

15、使用所述样品稀释液将所述生物素标记抗体稀释至0.1～0.5μg/ml的工作溶液，即得所述检测抗体溶液。

16、在以上技术方案中，所述试剂盒还包括裂解液、校准品、10×洗液、所述样品稀释液、hrp标记溶液、tmb底物显色液和终止液。

17、作为其中一种实施例，所述试剂盒包括包被hiv-1p24抗体的捕获板、裂解液、校准品(含不同浓度的hiv-1p24蛋白溶液)、10×洗液、样品稀释液、检测抗体溶液、hrp标记溶液、tmb底物显色液、终止液、封板膜、铝箔袋、产品说明书。

18、在以上技术方案中，所述样品稀释液的配制方法为：准确称取2.27gna2hpo4、0.54gkh2po4、16.01g nacl、0.40g kcl、40.00g蔗糖、20.00g bsa至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入1.00mltween-20、1.00ml proclin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至2.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。

19、在以上技术方案中，所述2#包被液的配制方法为：准确称取1.14g na2hpo4、0.27gkh2po4、8.01g nacl、0.20g kcl至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，定容至1.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得；

20、所述2#封闭液的配制方法为：称取1.14g na2hpo4、0.27g kh2po4、8.01gnacl、0.20g kcl、10.00g bsa至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入0.50mltween-20、0.50mlproclin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至1.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。

21、在以上技术方案中，所述10×洗液的配制方法为：准确称取11.36g na2hpo4、2.72gkh2po4、80.06g nacl、2.01g kcl至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入5.00ml tween-20、5.00ml proclin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至1.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得；

22、所述校准品的配制方法为：将recombinant hiv p24 protein放置于2～8℃条件下进行解冻，解冻后恢复室温，振荡混匀，瞬时离心后使用样品稀释液进行梯度稀释，配制成200pg/ml的standard 1，使用standard 1配制100pg/ml的standard 2，以此类推，2倍梯度稀释配制到3.125pg/ml的standard 7，样品稀释液为0pg/ml的standard 8；

23、所述hrp标记溶液的配制方法为：准确量取300ml样品稀释液至配制容器中，加入7.5μlhrp标记的链霉亲和素，配制成浓度为25ng/ml的工作溶液，即得；

24、所述终止液的配制方法为：准确量取270ml超纯水至配制容器中，加入30ml的10mol/l盐酸溶液，配制成浓度为1mol/l的工作溶液，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。

25、第二方面，本发明提供了一种慢病毒滴度检测方法，所述检测方法采用上述试剂盒进行。

26、在以上技术方案中，所述检测方法包括以下步骤：

27、s21，将所有试剂恢复至室温，并将10×洗液稀释至1×洗液；

28、s22，将所有样品恢复至室温；

29、s23，实验步骤：

30、在所述试剂盒对应的板孔中分别加入10μl裂解液，再加入90μl标准品和待测样品，用封板膜封板，放置于37℃孵育20-90分钟；

31、弃去溶液，每孔加入260μl 1×洗液，洗板，在吸水纸上拍干；

32、每孔加入100μl检测抗体溶液，用新的封板膜封板，放置于37℃孵育30分钟；

33、弃去溶液，每孔加入260μl 1×洗液，洗板，在吸水纸上拍干；

34、每孔加入100μl hrp标记溶液，用新的封板膜封板，放置于37℃孵育30分钟；

35、弃去溶液，每孔加入260μl 1×洗液，洗板，在吸水纸上拍干；

36、每孔中加入100μl tmb底物显色液，避光，室温孵育5-25分钟；

37、每孔中加入100μl终止液终止反应；

38、在15分钟内完成od 450nm读数；

39、s24，吸光度计算：

40、计算校准品与样品复孔吸光度均值；

41、以校准品浓度为横坐标，od值为纵坐标，用相关软件进行回归拟合生成校准曲线；

42、将样品对应的吸光度均值带入校准曲线，通过计算得出慢病毒滴度。

43、本发明的有益效果在于：

44、1、本发明试剂盒包括包被了hiv-1p24抗体的捕获板，使得该捕获板能特异性的识别hiv-1p24蛋白且不受杂蛋白干扰。

45、2、本发明试剂盒通过包被有hiv-1p24抗体的捕获板及生物素标记的hiv-1p24抗体的组合使用，可以特异性的识别hiv-1p24蛋白。

46、3、本发明试剂盒不受样品类型限制，可用于检测任何基于hiv-1的慢病毒的p24蛋白浓度。

47、4、本发明试剂盒建立了适用于快速检测任何基于hiv-1的慢病毒的p24蛋白浓度测定方法，为慢病毒滴度检测、复制型慢病毒(rcl)检测提供了一种简单、快速的检测工具。经验证，本发明试剂盒具有良好的线性、专属性、耐用性、精密度、准确度、检测限、钩状效应、稳定性，以及操作简便，检测周期短(单次检测时间在2小时内)等特点。