一种电化学适配体传感器及其制备方法和应用

本发明涉及传感器，特别涉及一种电化学适配体传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、黄曲霉毒素通常来源于黄曲霉和寄生曲霉，淀粉含量高的谷物及其制品易受霉变侵袭，导致黄曲霉毒素残留过多，严重影响了食品安全。目前已鉴定出的黄曲霉毒素有20多种类型，例如b1、b2、m1、m2、g1、g2。其中，黄曲霉毒素b1(afb1)表现出最强的毒性和致癌性，已被国际癌症研究机构归类为i类致癌物。因此，快速准确地检测食品中afb1具有重要意义。

2、在众多的检测方法中，基于电化学适配体的传感器技术具有检测时间短、灵敏度高且易于小型化等优点而受到广泛关注，在现场食品安全检测中具有潜在的应用价值。为了提高传感器的检测性能，通常会对电极表面的修饰策略进行研究，从而提高检测的灵敏度和准确性。

3、但是，对于现有的电化学适配体传感器而言，生物污染是影响其应用的关键因素之一。生物污染是指造成负面影响的非特异性黏附，即蛋白等大分子及微生物等可逆或不可逆地粘附到材料基底表面的过程。这层被吸附的蛋白质等可以作为微生物附着形成生物膜的平台，最终导致传感器故障。食品中基质复杂，在检测过程中不可避免地会污染传感器表面，影响传感器的特异性、稳定性及重复性。因此，赋予电化学适配体传感器表面以抗污特性对于提升传感器性能至关重要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种电化学适配体传感器，抗污染性强，并且具有灵敏度高、选择性和稳定好的特点。

2、本发明的第二方面在于提供一种电化学适配体传感器的制备方法。

3、本发明的第三方面在于提供一种电化学适配体传感器的应用。

4、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

5、本发明的第一方面在于提供一种电化学适配体传感器，包括核酸适配体和电极；所述电极表面含有聚多巴胺和两性离子聚合物；所述核酸适配体经过巯基修饰；所述核酸适配体修饰于所述电极表面。

6、可以理解的是，由于电极表面含有聚多巴胺和两性离子聚合物，因此将核酸适配体修饰于电极表面，是指将核酸适配体固定于电极表面的聚多巴胺和/或两性离子聚合物的之上。

7、电化学适配体传感器是指基于电化学核酸适配体的传感器，将核酸适配体固定于电极表面，也称为电化学核酸适配体传感器。本发明的电化学适配体传感器表面的两性离子聚合物含有两性离子基团，而带电官能团的溶剂化作用和氢键作用能使两性离子聚合物表面形成水合层，这种基于静电作用形成的水合层表面可有效阻抗非特异性吸附，具有较高的抗污性能，同时具备较高的重复性以及在较长时间保存下的稳定性。而多巴胺具有邻苯二酚的结构，可以黏附在多种物体的表面，在电极表面修饰多巴胺，多巴胺氧化聚合后能够将核酸适配体牢牢固定于电极表面，例如通过迈克尔加成固定。此外，聚多巴胺可以通过氢键结合水分子从而轻微提升传感器的抗污染性能。

8、采用巯基对适配体进行修饰，利用巯基的锚定作用，有利于固定修饰后的功能化探针，保证电化学适配体传感器的特异性。

9、本发明的电化学适配体传感器本身灵敏度高，无需再进行电信号增强。

10、需要注意的是，核酸适配体是修饰在表面含有聚多巴胺和两性离子聚合物的电极的表面，即在聚多巴胺和两性离子聚合物之上。

11、在本发明的一些实施方式中，所述电极包括玻碳电极。

12、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体包括afb1适配体；所述afb1适配体的核苷酸序列如seo id no:1所示；所述afb1适配体经巯基修饰后的序列为5′-sh-(ch2)6-gca tca cta cag tcattacgc atc ggg taagcg gaactg agg agt ggg agg taaatc gtgtgaagt gct gtc cc-3′。

13、本发明进一步选择afb1适配体，能够提升该电化学适配体传感器对于afb1的选择性，用于食品中afb1的快速检测中。

14、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体通过迈克尔加成固定于所述聚多巴胺上。

15、迈克尔加成具有反应条件相对温和、操作简单、收率高、区域选择专一等特点，相对其它加成方法更为简便。例如采用活化羧基后使其与含氨基的适配体交联的方法，需要加入活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚(胺edc)与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，另外还需要两次调节ph值才能使氨基与羧基成功连接，实验操作过程较为繁琐。

16、在本发明的一些实施方式中，所述两性离子聚合物包括cbma(羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯)和aema(n-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐)的共聚物；所述cbma与所述aema的摩尔比为1:(0.05～0.3)。

17、在本发明的一些实施例中，所述cbma与所述aema的摩尔比为1:(0.09～0.25)。

18、在本发明的一些具体实施例中，所述cbma与所述aema的摩尔比为1:(0.1～0.25)。

19、在本发明的一些示例中，所述cbma与所述aema的摩尔比为1:(0.1～0.12)。

20、本发明的电化学适配体传感器中，通过调整两性离子聚合物单体的摩尔比，能够进一步调整电化学适配体传感器的抗污染性、灵敏度、选择性、稳定性等性能。

21、在本发明的一些实施方式中，所述聚多巴胺和所述两性离子聚合物由多巴胺和两性离子聚合物经原位聚合得到，所述多巴胺与所述两性离子聚合物的质量比为(1.5～3.5):5，优选为(1.8～3.2):5，进一步优选为(2～3):5，更优选为(2～2.5):5。

22、应当理解的是，多巴胺与两性离子聚合物经原位聚合物，形成聚多巴胺和两性离子聚合物，以及部分多巴胺与两性离子聚合物的共聚物。

23、本发明的第二方面在于一种本发明第一方面所述电化学适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

24、将多巴胺和两性离子聚合物混合溶解，施加于电极表面，原位聚合；将核酸适配体修饰于所述电极表面，得到所述电化学适配体传感器。

25、应当理解的是，原位聚合后，所述多巴胺形成聚多巴胺。核酸适配体修饰于表面含有聚多巴胺和两性离子聚合物的电极的表面。

26、在本发明的一些实施方式中，所述多巴胺与所述两性离子聚合物的质量比为(1.5～3.5):5。

27、在本发明的一些实施例中，所述多巴胺与所述两性离子聚合物的质量比为(1.8～3.2):5。

28、在本发明的一些具体实施例中，所述多巴胺与所述两性离子聚合物的质量比为(2～3):5。

29、在本发明的一些示例中，所述多巴胺与所述两性离子聚合物的质量比为(2～2.5):5。

30、通过调整多巴胺与两性离子聚合物的质量比，也有利于提升电化学传感器的性能。

31、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体可以通过常规市售获得，或采用包括以下步骤的制备方法制得：

32、将巯基修饰的核酸适配体与tcep混合，室温下进行还原反应，将带有二硫键的巯基还原。

33、其中，tcep为三(2-羧乙基)膦。

34、在本发明的一些实施例中，所述还原反应的时间为25～35min。

35、在本发明的一些实施方式中，所述两性离子聚合物的制备方法包括以下步骤：

36、将两性离子单体化合物溶解，加入引发剂，在有机溶剂中混合，在无氧条件下聚合反应，得到所述两性离子聚合物。

37、在本发明的一些实施例中，所述引发剂包括4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(acva)。

38、在本发明的一些实施例中，所述有机溶剂包括二甲基亚砜(dmso)。

39、在本发明的一些实施例中，所述聚合反应的温度为65～75℃。

40、在本发明的一些实施例中，所述聚合反应的时间为23～25h。

41、在本发明的一些实施例中，所述聚合反应后还包括透析和冻干步骤；所述透析为超纯水透析，去除未反应的单体或低聚物。

42、在本发明的一些实施方式中，所述两性离子聚合物和多巴胺溶解于tris-hcl缓冲溶液；所述缓冲溶液的ph为8～9，浓度为9～11mmol/l。

43、在本发明的一些实施方式中，所述溶解后，所述两性离子聚合物的浓度为4～6mg/l；所述多巴胺的浓度为0.5～1.5mg/l。

44、在本发明的一些实施方式中，所述原位聚合的时间为3～5h。

45、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体设置于所述电极表面的步骤包括：将所述电极置于所述核酸适配体的溶液中，冷藏后得到所述电化学传感器；所述冷藏的温度为3～5℃。

46、在本发明的一些实施例中，所述冷藏的方式为置于冰箱中；所述冷藏的时间为7～9h。

47、在本发明的一些实施例中，所述核酸适配体的溶液浓度为1～5μmol/l。

48、在本发明的一些具体实施例中，所述核酸适配体的溶液浓度为2～4μmol/l。

49、本发明的第三方面在于提供一种本发明第一方面所述的电化学适配体传感器在食品安全检测中的应用。

50、本发明的电化学适配体传感器抗污染性强、灵敏度高、选择性好、稳定性好，且具有较高的重复性，能够用于检测食品中的毒素，尤其是afb1(黄曲霉毒素b1)，适用于食品安全检测中。

51、在本发明的一些实施方式中，所述检测的过程中，所述食品样品包括全麦面粉、纯牛奶粉或豆奶。

52、在本发明的一些实施方式中，所述电化学传感器应用于检测afb1。

53、在本发明的一些实施方式中，所述检测的过程中，所述afb1的检测限为0.15～0.25pg/ml。

54、在本发明的一些实施例中，所述检测afb1的过程包括如下步骤：

55、将食品样品稀释，加入afb1标准液，用本发明第一方面所述电化学适配体传感器检测；通过将检测前后的电信号带入构建的标准曲线中即可得到检测的afb1浓度。

56、在本发明的一些实施例中，所述检测的过程中，所述afb1的标准液的加标浓度为0.1～1ng/ml。例如可以是0.1ng/ml、0.5ng/ml或1ng/ml。

57、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

58、本发明提供的电化学适配体传感器在电极表面引入了聚多巴胺和两性离子聚合物，抗污染性强、灵敏度高，且稳定性好，同时通过巯基修饰核酸适配体，进一步提升了电化学适配体传感器的稳定性，对于目标检测物具有良好的选择性。该电化学传感器能够解决现有电化学适配体传感器在食品检测中容易被污染的问题，适用于食品安全检测，尤其是afb1的检测。