基于超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪同时测定血浆中PAGln和PAGly的方法与流程

本发明属于临床生物样品检测，具体涉及基于超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪同时测定血浆中pagln和pagly的方法。

背景技术：

1、苯乙酰谷氨酰胺(phenylacetylglutamine,pagln)和苯乙酰甘氨酸(phenylacetylglycine,pagly)是两种肠道微生物群的代谢物。苯乙酰谷氨酰胺(pagln)是由肠道微生物代谢苯丙氨酸(phenylalanine,phe)产生的代谢物，具体来说是由苯乙酸(phenylacetic acid,paa)与谷氨酰胺(glutamine)结合形成的。在人体中，pagln主要通过肝脏和肾脏中的谷氨酰胺结合反应形成。苯乙酰甘氨酸(pagly)主要在啮齿动物中形成，而在人类中较少见。pagly与pagln类似，也是通过微生物代谢途径产生的，但是它是通过苯乙酸与甘氨酸结合而形成。

2、现代研究表明，pagln和pagly水平的升高与心血管疾病的风险增加有关。pagln能够增强通过g蛋白偶联受体(gpcrs)受体α2a、α2b和β2adrs介导的血小板活化，影响血小板功能、增强血小板与胶原基质的粘附，通过促进血小板刺激依赖性ca+的升高和激动剂引起的聚集反应促进血栓形成等，还与心血管、脑血管和神经系统疾病的病理有关。pagly同样可以影响血小板的功能，pagly水平的升高会促进血小板的反应性和血栓生成，增加炎症风险等，此外，pagly还可以通过激活β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptors)来影响心脏功能。

3、现有技术中关于苯乙酰谷氨酰胺(pagln)和苯乙酰甘氨酸(pagly)这两种代谢物的检测方法，尽管已经取得了一些进展，但仍存在局限性和缺陷。首先由于pagln和pagly在人体中的浓度较低，样本处理过程中可能会遇到灵敏度不足的问题，并且这些代谢物在处理和储存期间可能会降解或转化进而导致数据不准确；其次对于现有部分分析方法而言，检测限和定量限可能不够低，无法准确捕捉到低浓度的pagln或pagly，特别是在健康个体中；此外，对于大规模人群筛查，需要考虑效率和成本效益比。

4、液相色谱三重四级杆串联质谱仪(lc-ms/ms with triple quadrupole massspectrometer)作为液质联用技术的分析工具，以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，将液相色谱(lc)的分离能力和质谱(ms)的检测能力相结合，实现了色谱和质谱的优势互补，具有高分离度和高选择性的优势，可用于复杂混合物中特定化合物的定性和定量分析，特别适用于需要高度特异性与灵敏度的应用领域，如药物分析、临床诊断、环境监测和食品安全检查等。

5、当前已有利用液质联用方法测定血浆中pagln的技术方案，例如公开号为cn112834656a，申请日为2021年1月27日的中国专利公开了一种基于uplc-ms/ms的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法，通过优化质谱参数和液相色谱方法，对20种包括芳香族氨基酸分解代谢、氧化三甲胺生物合成和组氨酸代谢等途径代谢的生物标志物进行高通量、高灵敏、高分离度的检测，但是该方法的20种生物标志物不包括pagly，无法实现对pagln和pagly的同时检测。

6、公开号为jp4555779b2，申请日为2004年12月24日的日本专利提供了血脂异常的预测方法，包括检测(a)苯乙酰甘氨酸和/或苯乙酰谷氨酰胺，或从苯丙氨酸到苯乙酰甘氨酸或苯乙酰谷氨酰胺的代谢途径中任选选择的代谢中间体，和(b)从马尿酸或苯丙氨酸通向马尿酸的代谢途径中的任何代谢中间体，并以两者的数量比为指标进行诊断，该方法虽然可以实现苯乙酰甘氨酸和/或苯乙酰谷氨酰胺的同时检测，但是在进行测定时还需要额外获取从马尿酸或苯丙氨酸通向马尿酸的代谢途径中的任何代谢中间体的含量，以两者的数量比为指标进行复合从而判断含量，不仅操作步骤复杂，且检测结果可能受到其余检测因素的干扰。

7、在公开的现有技术中，苯乙酰甘氨酸(pagly)的检测方法通常包含“以马尿酸-d5作为内标”这一技术特征，而检测苯乙酰谷氨酰胺(pagln)的现有技术方案中常常需要将待测样品与同位素内标混合。由于不同的内标物质与预处理方法，利用液质联用技术检测pagln和pagly时需要分别采集制备待测样品，分开进样与并设置各自所需要的检测分析条件。但pagln和pagly作为由肠道微生物群代谢产生的代谢物，并与多种健康状况尤其是心血管疾病和炎症性肠病有关，将面临越来越多需要同时检测二者的应用场景，因此开发一种利用液质联用技术同时检测pagln和pagly，并且灵敏度高、快捷高效的方法，不仅对心血管疾病的实验和临床研究具有重要意义和参考价值，而且可能为心血管疾病的预防和治疗提供新的策略。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供基于超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪同时测定血浆中pagln和pagly的方法，拥有高准确度、高灵敏度、高特异性以及所需样品体积少、样品前处理简单等优势。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的目的在于提供基于超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪同时测定血浆中pagln和pagly的方法，所述测定方法包括如下步骤：

4、s1、样品处理：将质控样品和血浆样品分别与沉淀试剂混合均匀，充分萃取后离心取上清液，即待测样品；

5、s2、使用超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对所述待测样品进行检测，依次经过液相分离和质谱检测；

6、所述液相分离采用c18分析柱，采用梯度洗脱方式进行分离，在梯度洗脱过程中，流动相a占整个流动相的10～95％；

7、所述质谱检测采用多反应检测srm模式，离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为正离子3200v，负离子3000v，雾化温度为350℃，鞘流气压力40arb，辅助气压力15arb；

8、s3、测得所述待测样品中pagln和pagly的峰面积，将其分别带入标准曲线中通过线性方程进行定量，得到待测样品中pagln和pagly的含量。

9、进一步地，所述s1中质控样品制备如下：

10、精确称取pagln和pagly置于容量瓶中，配制混合标准品储备溶液，采用甲醇逐级稀释标准品储备溶液，制得系列混合对照品溶液；

11、然后，取不同空白血浆样品各50μl置于洁净离心管中，分别加入低、中、高不同浓度的系列混合对照品工作液并充分混匀，即得质控样品。

12、进一步地，所述系列混合对照品工作液中pagln浓度范围为0.01～1000ng/ml，pagly浓度范围为0.1～5000ng/ml。

13、进一步地，系列混合对照品工作液设置如下：

14、 化合物(浓度μg/l) std1 std2 std3 std4 std5 std6 std7 std8 pagln 0.001 0.01 0.1 0.5 1 10 50 100 pagly 0.01 0.1 1 5 10 100 500 1000

15、进一步地，所述s1中分别取血浆样品与质控样品，加入沉淀试剂涡旋1～5min充分沉淀，于4℃下13000rpm离心15min后取上清液，置于液相小瓶中即待测样品；所述沉淀试剂为甲醇，加入的沉淀剂剂与血浆样品、质控样品的体积比为3:1。

16、进一步地，所述s2中分析色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm，柱温为40℃。

17、进一步地，所述s2中梯度洗脱方式中流动相由流动相a和流动相b组成，梯度洗脱程序如下：

18、

19、所述流动相a为甲酸水溶液、乙酸水溶液或甲酸铵溶液，所述流动相b为乙腈或甲醇。

20、进一步地，所述s2中pagln的检测采用正离子模式，检测母离子：265.128m/z，子离子：84.113,91.054,129.97m/z。

21、进一步地，所述s2中pagly的检测采用负离子模式，检测母离子：191.930m/z，子离子：74.054,90.97,117.03m/z。

22、进一步地，所述s2中所述检测分析时间为8min。

23、进一步地，具体质谱参数为：pagln:m/z＝129.40-130.40f:+cessrmms2265.12884.112-84.114,91.053-91.055129.969-129.971]；

24、pagly:m/z＝73.55-74.55f:-c essrm ms2 191.93074.053-74.055.90.969-90.971117.035-117.0371。

25、进一步地，所述s3中所述线性方程获得方法如下

26、a1、分别吸取所述系列混合对照品工作液2μl于1.5ml洁净离心管中，加入室温解冻的空白组大鼠血浆48μl，混匀后得到含不同浓度标准品的系列血浆样品；

27、a2、向系列血浆样品中分别加入150μl甲醇涡旋1min，于4℃下13000rpm离心15min后取上清液，供超高效液相色谱串联质谱检测，测得含不同浓度标准品的系列血浆样品的pagln和pagly的峰面积an；

28、a3、另取2μl空白甲醇置于离心管中，加入室温解冻的空白组大鼠血浆48μl，混匀后得到空白血浆样品；

29、a4、向空白血浆样品中加入150μl甲醇涡旋1min，于4℃下13000rpm离心15min后取上清液，供超高效液相色谱串联质谱检测，测得空白血浆样品的pagln和pagly的峰面积a0；

30、a5、以峰面积比值y对血浆中化合物浓度x作回归计算，得到线性方程。

31、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

32、1、本发明首次提出利用超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪同时测定血浆中pagln和pagly的技术方案，将液相色谱(lc)的高分离能力和质谱(ms)的高选择性及灵敏度结合起来，使得各种复杂的待测样品能够在液相色谱中先进行分离，然后由质谱进行精确的定性和定量分析，克服了现有技术中由于pagln和pagly在血浆中含量较低而难以被检测到的缺陷。同时本发明在检测苯乙酰甘氨酸(pagly)和苯乙酰谷氨酰胺(pagln)时无需设置不同的内标物质与梯度洗脱方式，仅通过调控液相色谱三重四级杆串联质谱仪的正负离子模式，即可在同份待测样品中实现pagln和pagly的同时检测。

33、2、本发明所创新的测定方法中采用多反应监测(mrm)模式来提高定量分析的准确性，可以有效地识别目标化合物，在较短的时间内完成待测样品的分析，实现血浆样品中pagln和pagly的同时测定，对于心血管疾病的诊断具有重要的实用价值和参考意义。并且本发明所述测定方法预处理方法简便，待测样品经甲醇沉淀处理后直接进样，且液相方法无需使用亲水填料分析色谱柱，适用于常规测定，具有降低检测成本，减少样品用量，方便快捷，提高工作效率等优势。

34、3、本发明所述基于超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪同时测定血浆中pagln和pagly的方法具有较强的抗基质干扰能力，可以检测广泛的样本类型，包括生物样品、环境样品和食品样品等，能够在多种应用场景中检测pagln和pagly的含量。本发明方法下pagln的保留时间为5.27min，pagly的保留时间为5.67min，无杂峰干扰测定，且pagln和pagly线性相关系数均在0.995以上，检测限(lod)、定量限(loq)均达到良好水平，确保了测定结果的可靠性。