一种实现蛋白或病毒标记的方法与流程

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种实现蛋白或病毒标记的方法。

背景技术：

1、蛋白质是生命活动最重要的功能分子，蛋白质之间特定的相互作用构成了细胞内生物化学反应网络的重要组成部分，对蛋白质之间的互作机理研究可以加深我们对生命活动规律的认识。量子点(qds)是一种具有高亮度和光稳定性的半导体纳米晶体，是一种理想的检测和跟踪标签，可以用于蛋白质的可视化追踪。同样的，蛋白(或病毒)与荧光蛋白的交联技术在细胞生物学、免疫学、分子生物学等领域广泛应用。例如，通过将荧光蛋白标记的抗体与特定蛋白结合，可以实现对蛋白的定位和表达水平的检测；通过将荧光蛋白标记的抗体与细胞结合，可以实现对细胞的追踪和成像。

2、蛋白或病毒标记技术是使用特定的化学试剂，将蛋白(病毒)间或蛋白质(病毒)与其他物质进行固定结合。交联过程中，共价键的形成可能伴随着消去部分基团，也可能伴随着附加部分基团。目前常用的化学交联剂分为四类。第一类，与伯胺基团反应的交联剂(如n-羟基琥珀酰亚胺)，被广泛用于与蛋白质赖氨酸残基上的n端和ε-氨基形成稳定的共价键，具有较高的反应效率。第二类，巯基反应交联剂，可以通过烷基化(卤乙酰基)或二硫键交换(马来酰亚胺、吡啶二硫醇)修饰目标蛋白上的巯基。第三类交联剂可将蛋白质c端羧基和天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基团交联(如甲醛、戊二醛)。最后，第四类主要通过紫外光激活形成交联的光反应性交联剂(二叠氮类、芳基叠氮类)，其优点在于可以通过控制光源的时间和强度来调节反应强弱。采用上述化学交联剂会出现副产物多，如抗体之间的复合物、荧光蛋白等之间复合物的副产产生，并且偶联效率低，选择性低，易造成发光材料荧光淬灭等问题。

3、综上，开发一种低细胞毒性、选择性高、合成简单、成本低廉、荧光淬灭低的实现蛋白或病毒标记的方法，成为了亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实现蛋白或病毒标记的方法。本发明提供的方法具备成本能耗低、生产安全等优点，无高细胞毒性副产物产生，实现了蛋白或病毒的定向标记，无抗体之间的复合物以及荧光蛋白之间等其他复合物的副产产生。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

2、本发明的目的在于提供一种实现蛋白或病毒标记的方法，利用量子点或荧光蛋白对蛋白或病毒进行标记，将肼片段与蛋白或病毒上的氨基进行偶联，醛片段与量子点或荧光蛋白上的氨基进行偶联，再将连有不同组分的醛片段与肼片段进行偶联从而实现了蛋白或病毒的标记；所述肼片段以6-氯烟酸为原料制得；

3、

4、其中，r1和r2各自独立地选自h、烷基、硝基、三氟甲基、三氟乙基、-so4na、-ch2so4na、-c2h4so4na，其中烷基中的碳原子个数不大于6。

5、本发明对蛋白或病毒进行标记，从而实现了蛋白或病毒的可视化，能够实现荧光蛋白-蛋白、荧光蛋白-病毒、量子点-蛋白、量子点-病毒的偶联。蛋白可以选自人血清蛋白(hsa)、小牛血清蛋白(bsa)、鸡卵白蛋白(ova)等中的一种；病毒可以选自甲型流感病毒(h9n2，h1n1)、烟草花叶病毒中(tmv)等中的一种；荧光蛋白可以选自绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)等中的一种；量子点(qds)为氨基修饰的半导体量子点，可以选自硒化镉量子点(cdse qds-nh2)、硫化镉量子点(cds qds-nh2)、硒化锌量子点(znse qds-nh2)等中的一种；以上蛋白、病毒、荧光蛋白及量子点的种类并不限于以上所列举的类型，其他未列举的种类同样适用。

6、具体地，所述肼片段的制备方法包括如下步骤：

7、(1)将6-氯烟酸与水合肼发生取代反应，得到中间体a；

8、(2)向中间体a中加入丙酮和对甲苯磺酸，缩合得到中间体b；

9、(3)将中间体b、r1取代的n-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂反应生成肼片段；

10、

11、优选地，步骤(1)中，所述6-氯烟酸与水合肼的物质的量比为1:(2-2.5)；

12、优选地，步骤(1)中，所述反应的温度为回流温度，反应时间为4-6h；更为优选地，反应时间可以为4h、4.2h、4.4h、4.6h、4.8h、5h、5.2h、5.4h、5.6h、5.8h或6h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

13、优选地，步骤(2)中，所述中间体a与对甲苯磺酸的物质的量比为1:(0.05-0.1)。

14、优选地，步骤(2)中，以丙酮为原料和溶剂，所述中间体a与所述丙酮的质量体积比为1g:(8-12)ml。

15、优选地，步骤(2)中，所述反应的温度为回流温度，反应时间为8-12h；更为优选地，反应时间可以为8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h或12h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

16、优选地，步骤(3)中，所述中间体b、r1取代的n-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂的物质的量比为1:(1.1-1.2):(1.2-1.5)。

17、优选地，所述缩合剂为选自dcc、edci、hbtu、cdi中的一种或多种；

18、优选地，步骤(3)中，所述反应的温度为25-30℃，反应时间为3-6h；更为优选地，反应温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，反应时间可以为3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h等；但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

19、具体地，所述醛片段的制备方法包括如下步骤：4-甲酰基苯甲酸、r2取代的n-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂反应生成醛片段；

20、

21、优选地，所述4-甲酰基苯甲酸、r2取代的n-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂物质的量比为1:(1.1-1.2):(1.2-1.5)；

22、优选地，所述缩合剂为选自dcc、edci、hbtu、cdi中的一种或多种；

23、优选地，所述反应的温度为25-30℃，反应时间为3-6h；更为优选地，反应温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，反应时间可以为3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h等；但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

24、与现有技术相比，本发明提供一种实现蛋白或病毒标记的方法，具有如下

25、有益效果：

26、(1)本发明通过肼片段和醛片段的制备，分别用于与蛋白(病毒)、荧光蛋白(量子点)上的氨基进行偶联，从而实现蛋白或病毒的标记；

27、(2)本发明肼片段和醛片段的合成路线，无高细胞毒性副产物产生，安全系数高，反应收率高，分离纯化简单；该类蛋白或病毒标记的方法适用性广，反应条件温和，选择性好，偶联效率高，对荧光蛋白或量子点荧光淬灭少，能够实现蛋白的可视化；实现了荧光蛋白-蛋白、荧光蛋白-病毒、量子点-蛋白或量子点-病毒的定向偶联，无蛋白和蛋白、病毒和病毒、量子点和量子点之间偶联的复合物的副产产生。