一种基于固相萃取法提取和检测血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素的方法及试剂盒与流程

本发明涉及褪黑素检测，具体地说，涉及一种基于固相萃取法提取和检测血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素浓度的方法及试剂盒。

背景技术：

1、氨基酸类神经递质和褪黑素主要包括γ-氨基丁酸(gaba)、5-羟色胺(5-ht，血清素)、5-羟基色氨酸(5-htp)和褪黑素(mt)，在临床上可以用于辅助诊断睡眠障碍内分泌相关疾病。

2、睡眠是一种复杂的生理过程，在睡眠期间，身体会进行自我修复，利于身体恢复和生长，缺乏睡眠会导致情绪不稳定，增加焦虑和抑郁的风险。人们一生中大约有三分之一的时间在睡眠中度过，缺乏高质量的睡眠不仅影响人们在白天的活动，而且还会损害自身免疫系统功能，长期易形成睡眠障碍。现代社会中睡眠障碍的发生率非常高，据估计，睡眠障碍影响至少20-40％的成年人，同样各种类型的睡眠困难也影响着25-62％的儿童，影响他们的发育状态。

3、γ-氨基丁酸是人体中一种重要的具有镇静作用的抑制性神经递质，研究表明其在人脑能量代谢过程中起重要作用，具有改善睡眠的作用，可以作为睡眠诱导剂。研究表明，体内γ-氨基丁酸含量异常易引起神经障碍类疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症、精神分裂症、孤独症以及急性创伤后应激障碍症等。缺乏氨基丁酸时，人容易产生焦虑不安等情绪。

4、褪黑素是由脑垂体松果体分泌，具有催眠、镇静作用，它的任务是调节昼夜节律和睡眠模式。褪黑素水平低下是引起失眠的重要诱因之一，补充褪黑素及其相关前体则有助于改善睡眠。有研究表明富含色氨酸的早餐、规律的早晨光照和晚上补光相结合可以改善晚上褪黑激素的分泌，从而改善睡眠质量，使入睡所需的时间减少。通过用5-羟基色氨酸治疗也可以积极影响觉醒水平，从而减少儿童的睡眠夜惊行为。5-羟色胺(5-ht)又名血清素，是褪黑素的前体，通过不同的神经通路，在调节睡眠-觉醒的节律及中枢性疲劳中发挥重要作用。研究表明动物脑内5-ht含量降低，实验动物将出现失眠，提高5-ht水平能有效改善失眠症患者的临床症状。

5、目前常用是进行蛋白沉淀、丹磺酰氯衍生等方法进行提取和衍生。由于γ-氨基丁酸属于两性化合物，5-羟色胺和5-羟基色氨酸属于酸性物质，褪黑素属于中性物质，一同检测比较困难，关于血浆中γ-氨基丁酸，5-羟色胺，5-羟基色氨酸和褪黑素的一同检测尚未见报道，本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种同时检测γ-氨基丁酸，5-羟色胺，5-羟基色氨酸和褪黑素浓度的方法。由于γ-氨基丁酸，5-羟色胺，5-羟基色氨酸和褪黑素在睡眠调节中的关键作用，血清中相关物质的检测可了解其在体内的浓度水平，从而帮助临床医生更好地对睡眠障碍-失眠症患者进行诊断、治疗、评估疗效，具有重要的临床意义。

6、谱络(武汉)医学生物科技有限公司的专利申请cn118759076a提供了一种与抽动障碍相关的神经递质的检测方法，主要为神经递质检测方法，与本发明相同的检测指标仅包括2种化合物(5-羟色胺和γ-氨基丁酸)，沉淀剂为含酸异丙醇需要在-20℃至-60℃的温度下预冷5-20min，而且需要在50℃条件下孵育10min，随后才能进行检测。通过沉淀剂低温处理、调节ph、高温衍生等一系列处理后进行lc-ms/ms检测，操作步骤极其复杂，费时费力，同时存在衍生化不完全，影响化合物灵敏度检测。

7、合肥歆智医疗器械有限公司的专利申请cn118226045a提供了一种同时检测十种以上标志物的检测方法、试剂和检测系统，主要为生物标志物，包括神经递质检测方法，与本发明相同的检测指标包括2种化合物(γ-氨基丁酸和5-羟基色氨酸)，且通过蛋白沉淀、调节ph、离心等进行lc-ms/ms检测，操作复杂，耗时长。且有文献报道，健康人血浆γ-氨基丁酸浓度为13.40±2.75ng/ml，该专利检测线性低点为4nmol/l(38ng/ml)，大大超出健康人血浆中γ-氨基丁酸浓度范围，对于血浆中γ-氨基丁酸的临床检测没有太大参考价值。

8、裕菁科技(上海)有限公司的专利申请cn118817928a公开了一种基于wcx固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法。主要为褪黑素、血清素检测方法，与本发明相同的检测指标包括2种化合物，该专利方法并不能同时提取血浆中γ-氨基丁酸，对于本发明无参考意义。γ-氨基丁酸作为人体内源性物质的，分子量小(仅为103.12)，结构简单无紫外吸收，且其极性很强(logp＝-3.17)。同时褪黑激素quest诊断给出的参考范围白天是2.0-80pg/ml；夜间是18.5-180.0pg/ml，因而要求检测正常人血浆中褪黑素有足够灵敏度。且现有文献报道血清素的log p也非常低，γ-氨基丁酸和血清素这些化合物都不能被c18基质的spe所萃取，而褪黑素的富集方法所有的公开报道均是采用c18基质的spe方法，因此固相萃取板需采用混合型离子交换混合模式吸附剂。该专利申请采用阳离子交换基质的wcx spe板适用于季胺盐类化合物萃取，用于强碱化合物提取。而γ-氨基丁酸(pi＝7.295)其化合物结构基团有羧基和羟基，褪黑素为中性化合物，本发明则采用混合阴离子固相萃取板填料带有c18基质和阳离子交换基质特点，对于γ-氨基丁酸、5-羟色胺、5-羟基色氨酸、褪黑素4个化合物联检具有更好的效果。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于固相萃取法提取和检测血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素浓度的方法和试剂盒。具体地说，本发明公开了一种基于混合型阴离子交换固相萃取板(max spe)用于提取血浆中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,简称gaba)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，简称5-ht)、5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptamin，5-htp)、褪黑素(melatonin，简称mt)的方法。本发明包括如下步骤：首先利用混合型阴离子交换固相萃取板对血浆中γ-氨基丁酸、5-羟色胺、5-羟基色氨酸和褪黑素进行提取和富集，然后通过超高效液相色谱进行样品分离，最后进入质谱检测。本发明利用混合型阴离子交换固相萃取板提取已知浓度4种物质标准品和内标，最后通过液相色谱串联质谱进行检测，建立标准曲线，从而计算人血浆中4种神经递质类物质的浓度。该方法可以对辅助诊断精神分裂症，睡眠障碍、心理医学疾病诊断等内分泌相关疾病。以及疾病的发展过程、疗效和预后评估具有十分重要的意义，从而为患者提供个性化的诊断治疗信息。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种基于固相萃取法提取和检测血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素浓度的方法，包括如下步骤：

4、s1、利用混合型阴离子交换固相萃取板对血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素进行提取和富集；

5、s2、通过超高效液相色谱进行样品分离；

6、s3、进行质谱检测；

7、s4、基于标准曲线法计算样品中褪黑素和氨基酸类神经递质的含量。

8、作为本发明的一些具体实施方式，所述氨基酸类神经递质包括γ-氨基丁酸、5-羟色胺(血清素)和5-羟基色氨酸中的至少一种。

9、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s1具体包括：

10、s11、使用甲醇活化混合型阴离子交换固相萃取板；

11、s12、加入超纯水以平衡固相萃取板；

12、s13、将标准品、质控品或血浆样本与内标溶液和氨水溶液混合后上样于固相萃取板，(采用加压装置)加压富集，弃去流出液；

13、s14、(在正压装置的作用下)使用氨水溶液作为淋洗液ⅰ，淋洗截留在固相萃取板上的目标物质，除去杂质，弃去流出液；

14、s15、使用甲醇水溶液作为淋洗液ⅱ，进行二次淋洗，再次淋洗截留在固相萃取板上的目标物质，除去杂质，弃去流出液；

15、s16、用含乙酸的甲醇洗脱截留在固相萃取板上的目标物质；

16、s17、氮吹至干，加入超纯水复溶，温和振荡混匀。

17、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s13中，所述内标溶液为含10-50ng/mlγ-氨基丁酸-d2、5-20ng/ml 5-羟色胺-d4、5-20ng/ml 5-羟基色氨酸-d3、10-50pg/ml褪黑素-d3的80％-100％(v/v)的甲醇溶液。

18、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s13中，所述氨水为质量分数1％-5％的氨水溶液。

19、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s14中，所述淋洗液ⅰ为质量分数1-5％的氨水溶液；

20、和/或，步骤s15中，所述淋洗液ⅱ为40％-50％(v/v)的甲醇水溶液。

21、作为本发明的而一些具体实施方式，步骤s16中，所述含乙酸的甲醇中，乙酸的质量百分比含量为2％-5％。

22、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s2中，进行液相色谱时，流动相a为含5-20mm乙酸铵和0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相b为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈。

23、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s3中，进行液相色谱时，流动相的洗脱梯度为：

24、

25、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s3中，质谱条件为：

26、

27、

28、作为本发明的一些具体实施方式，步骤s3中，质谱参数表为：

29、 化合物 母离子 子离子 碰撞电(v) gaba 104.0 45.0 21 gaba 104.0 87.0 10 gaba_d2 106.1 89.0 10 5-ht 177.1 115.0 28 5-ht 177.1 160.1 10 5-ht_d4 181.1 164.1 11 5-htp 221.2 162.0 18 5-htp 221.2 204.0 9 5-htp_d3 224.2 206.1 10 mt 233.2 130.0 46. mt 233.2 174.1 14 mt_d3 236.2 174.1 13

30、第二方面，本发明提供一种基于固相萃取法提取检测血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素的试剂盒，采用上述任一项所述的方法对血浆中氨基酸类神经递质和褪黑素进行提取检测。

31、本发明的方法和试剂盒有助于睡眠障碍-失眠症患者的诊断、治疗、以及评估疗效，具有重要的临床意义。

32、发明人同一时期的研发课题“一种基于磁性吸附剂提取和检测血浆中褪黑素及其合成通路中相关物质的方法和试剂盒”与本发明相同的检测指标有3个。采用该课题中的方法，即磁性混合型强阳离子交换吸附剂(mcx)对本发明的γ-氨基丁酸、5-羟色胺、5-羟基色氨酸和褪黑素进行提取富集，首先采用4％(v/v)的磷酸酸化待测样本，待测样本中的γ-氨基丁酸在4％磷酸作用下可交换吸附于磁性吸附固相萃取板上，之后采用含氨水的有机相溶剂进行洗脱，检测结果发现γ-氨基丁酸和其内标均在保留时间附近出现干扰杂峰，从而影响γ-氨基丁酸的定量，故该课题的方法不适用于对本技术中饿γ-氨基丁酸进行提取富集和检测。

33、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

34、1)通过混合型阴离子交换固相萃取板可以快速实现γ-氨基丁酸、5-羟色胺、5-羟基色氨酸、褪黑素的提取，为氨基酸类神经递质和褪黑素快速提取和检测提供实验方案；

35、2)通过固相萃取板处理样本，可以有效去除血浆中的蛋白及无机盐，利于仪器检测，对于大通量样本的检测具有重要意义；

36、3)淋洗剂中有机试剂的浓度较低，可以更好的淋洗掉水溶性的杂质，减少杂质的干扰，从而提高目标化合物的检测灵敏度；

37、4)固相萃取时，分别使用1％的氨水溶液和50％的甲醇溶液进行两步淋洗，1％的氨水溶液淋洗以去除吸附在固相萃取板上的杂质，用50％的甲醇溶液则是根据本技术化合物的特性，选用了合适的有机试剂以进一步去除板上的杂质，减少杂质的干扰，以提高目标化合物的检测灵敏度。