分离测定骨化三醇中间体Z3及其异构体杂质的方法与流程

本发明属于药物分析，具体涉及一种分离测定骨化三醇中间体z3及其异构体杂质的方法。

背景技术：

1、骨化三醇是人体内维生素d3最重要的代谢活性产物之一，具有广泛的临床应用。其可制成各种制剂，用于绝经后和老年性骨质疏松，慢性肾功能衰竭尤其是接受血液透析病人之肾性骨营养不良症，术后甲状旁腺功能低下，特发性甲状旁腺功能低下，假性甲状旁腺功能低下，维生素d依赖性佝偻病及低血磷性维生素d抵抗型佝偻病等。

2、骨化三醇以无水物和一水合物两种形式存在，无水物化学名称为(5z,7e)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1α,3β,25-三醇，分子式为c27h44o3，分子量为416.64，结构式如式ⅰ所示；一水合物化学名称为(5z,7e)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1α,3β,25-三醇一水合物，分子式为c27h44o3·h2o，分子量为434.65，结构式如式ⅱ所示。

3、

4、骨化三醇原料药的合成过程中，中间体b3与中间体z2反应得到骨化三醇中间体z3，在这个过程中容易产生其异构体杂质——杂质z3b。中间体b3的结构式如式ⅲ所示，中间体z2的结构式如式ⅳ所示。骨化三醇中间体z3(简称cat-z3)的化学名称为((1r,3s,z)-5-(2-((1r,3as,7ar,e)-7a-甲基-1-((r)-6-甲基-6-((三乙基硅烷基)氧基)庚烷-2-基)八氢-4h-茚-4-亚基)亚乙基)-4-亚甲基环己烷-1,3-二基)双(氧基))双(叔丁基二甲基硅烷)，其分子式为c45h86o3si3，分子量为759.44，结构式如式ⅴ所示。杂质z3b的结构式如式ⅵ所示。

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6、对于制备骨化三醇过程中产生的杂质或引入的有关物质，需要在中间体中进行严格控制。然而暂无相关专利或文献资料对骨化三醇中间体z3中杂质z3b的分析方法进行报道，仅部分现有技术公开了骨化三醇中其他有关物质的分析方法。例如，cn116466016b专利公开了一种骨化三醇口服液中有关物质含量的测定方法，其采用高效液相色谱法对骨化三醇口服液中骨化三醇前体和降解杂质进行测定，色谱柱为硅胶柱；流动相是体积比为40:60:1的乙醇、正己烷和异丙醇，流速为0.8-1.2ml/min。该方法难以实现骨化三醇中间体z3中杂质z3b的有效分离。

7、因此，需要建立新方法对骨化三醇中间体z3及其有关物质进行分离和测定，以控制最终成品骨化三醇的质量。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于高效液相色谱法分离骨化三醇中间体z3及其异构体杂质的方法，该方法可以在较短的时间之内完成多种物质的分离。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、基于高效液相色谱法分离骨化三醇中间体z3及其异构体杂质的方法，所述异构体杂质为杂质z3b，所述骨化三醇中间体z3和所述杂质z3b共同组成组合物；

4、各化合物的结构式如下：

5、

6、所述高效液相色谱法中，流动相：以甲醇和乙腈的混合溶液为流动相a，以乙酸乙酯为流动相b，所述流动相a中甲醇和乙腈的体积比为50-70：5-25；固定相：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，进行线性梯度洗脱。

7、分离检测后用于下一步生产。

8、作为优选，所述流动相a中甲醇和乙腈的体积比为58-62：13-17，最优选为60：15。

9、进一步，所述线性梯度洗脱的程序如下：

10、 时间(分钟) 流动相a-体积份 流动相b-体积份 0 75±10 25±10 5±1 75±10 25±10 50±1 60±10 40±10 60±1 60±10 40±10 61±1 75±10 25±10 70±1 75±10 25±10

11、。

12、作为优选，所述流动相中甲醇、乙腈、乙酸乙酯的初始体积比为58-62：13-17：23-27，最优选为60：15：25。这里的初始体积比指的是洗脱时间为0、5、61、70分钟时的比例。

13、作为优选，所述线性梯度洗脱的程序如下：

14、 时间(分钟) 流动相a-体积份 流动相b-体积份 0 73-77 23-27 5 73-77 23-27 50 60 40 60 60 40 61 73-77 23-27 70 73-77 23-27

15、。

16、作为最优选，所述线性梯度洗脱的程序如下：

17、 时间(分钟) 流动相a-体积份 流动相b-体积份 0 75 25 5 75 25 50 60 40 60 60 40 61 75 25 70 75 25

18、。

19、进一步，流速为1.0～2.0ml/min；柱温为20～30℃。

20、作为优选，流速为1.4～1.6ml/min；柱温为23～27℃。例如，流速为1.4ml/min(图8)；或流速为1.5ml/min(图4)；或流速为1.6ml/min(图9)。又如，柱温为23℃(图10)；或柱温为24℃；或柱温为25℃(图4)；或柱温为26℃；或柱温为27℃(图11)。

21、作为最优选，流速为1.5ml/min；柱温为25℃。

22、作为优选，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

23、作为最优选，所述色谱柱选择agilent zorbax eclipse xdb-c18，4.6mm×250mm，5μm。

24、作为优选，进样体积为50μl。

25、作为优选，运行时间为70分钟。

26、本发明的目的之二在于提供一种鉴别骨化三醇中间体z3及其异构体杂质的方法，该方法可以在较短的时间之内完成多种物质的鉴定。

27、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

28、鉴别骨化三醇中间体z3及其异构体杂质的方法，采用前述方法分离所述组合物，并进入检测波长为264±10nm的检测器进行检测，得到色谱图；通过比较检测品与对照品的色谱图谱特征，来确定检测品中是否含有骨化三醇中间体z3及其异构体杂质。

29、关于检测波长：±10nm的设定范围是基于误差考虑、方法优越性和实际应用需求等多方面因素的综合考虑。这一设定范围有助于确保检测结果的可靠性、提高测量的重复性和灵活性，并满足特定实验的要求。

30、作为最优选，检测波长为264nm。

31、作为优选的方案，按照相对保留时间的先后顺序，可以鉴定出组合物中的各组份，所述组合物的组份按照升序依次为：骨化三醇中间体z3、杂质z3b。

32、通常情况下，相对保留时间是用于描述混合物中不同组分在色谱柱上的相对保留程度，它是指某一组分的保留时间与参考组分(通常是主峰或已知组分)的保留时间的比值。这个比值反映了不同组分在色谱柱上的相对保留性能，是色谱分析中用于定位、定性和定量分析的重要参数。相对保留时间的计算方法是将目标组分的保留时间(tr)除以参考组分的保留时间(tr0)。

33、作为优选的方案，以骨化三醇中间体z3为参照峰，相对保留时间为1.05±0.02，判定为所述杂质z3b。

34、除了相对保留时间，也可以用保留时间来判定组组份。保留时间是指样品从进入色谱柱到被检测器检测到所需的时间。这个时间是根据组分在色谱柱上的移动速度计算的，即从进样开始到某个组分的色谱顶点(浓度极大值)的时间间隔。主要用于确定样品中各组分的出峰顺序和位置，是色谱分析中的基本数据之一。在质量控制中，保留时间的变化可以反映色谱柱的状态、流动相的稳定性以及仪器的性能等因素。

35、本发明的目的之三在于提供一种测定骨化三醇中间体z3及其异构体杂质含量的方法，该方法可以在较短的时间之内完成多种物质的鉴定及含量测定。

36、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

37、测定骨化三醇中间体z3及其异构体杂质含量的方法，采用前述方法分离并鉴别骨化三醇中间体z3及其异构体杂质，得到色谱图；根据所得色谱图，采用主成分自身对照法计算杂质含量。

38、通过含量测定，我们进一步可以用于判定骨化三醇中间体z3及其异构体杂质含量是否合格。若杂质z3b的峰面积大于对照溶液中对应杂质的峰面积，表明杂质含量不合格；反之，若杂质z3b的峰面积不大于对照溶液中对应杂质的峰面积，表明杂质含量合格。

39、上述判定方式可以作为药品质量判定模型，进一步作为智能化生产流程中不可或缺的一个关键模块。该模型通过精确控制流动相组成、流速、柱温等参数，实现对药品中活性成分、杂质及降解产物的精准分离与定量分析，为药品质量的全面评估提供了科学依据。在智能化生产体系中，这一模型被无缝集成，能够实时接收来自生产线的原始数据，自动执行分析任务，并基于预设的质量标准迅速反馈判定结果。

40、作为优选的方案，样品配制溶剂为乙酸乙酯和乙腈的混合溶液。

41、作为优选的方案，所述样品配制溶剂中，乙酸乙酯和乙腈的体积比为70：30。

42、作为优选的方案，分离前，利用所述样品配制溶液配制待测溶液，所述待测溶液包括样品溶液、对照溶液和/或系统适用性溶液。具体步骤如下：

43、(1)样品溶液：精密称取本品(骨化三醇中间体z3)10.41mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(临用现配)

44、(2)对照溶液：精密移取样品溶液0.5ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

45、本发明的有益效果在于：

46、1.本发明提供了一种专属、灵敏的高效液相色谱法，用于分离测定骨化三醇中间体z3中杂质z3b。该方法能够实现骨化三醇中间体z3中杂质z3b的有效分离与测定，对杂质z3b进行有效控制，从根本上确定了产品质量，具有专属、灵敏、简便、快速、准确度高等优点。

47、2.本发明方法具有分离效果好、分离时间短(70分钟)的特点。本方法创造性地使用反相色谱柱，以正相流动相对杂质进行洗脱，并采用梯度洗脱方法，提高杂质的峰型及分离效果。该方法对于实现骨化三醇中间体z3的质量控制具有重要的意义。

48、3.本发明方法具有高灵敏度的特点。在本色谱系统下，骨化三醇中间体z3的定量限浓度为0.3911μg/ml，检测限浓度为0.1173μg/ml；杂质z3b的定量限浓度为0.3897μg/ml，检测限浓度为0.1169μg/ml。

49、4.本发明方法具有耐用性好的特点。当流速、柱温、流动相比例有微小波动时，主峰与邻近杂质峰间、各杂质峰间的谷高比均大于2.0。