双酚类物质暴露的内源标志物及评估暴露毒性效应的方法与流程

本发明属于化学物环境毒理及风险评价领域，具体涉及双酚类物质暴露的内源标志物及评估暴露毒性效应的方法。

背景技术：

1、双酚a（bpa）是一种广泛应用于塑料、食品包装、热敏纸和橡胶中的塑料添加剂。众多动物学和人群流行病学研究表明，bpa具有明显内分泌干扰效应，长期暴露于环境剂量bpa可显著增加神经退行性疾病、行为问题、生殖紊乱和癌症的发生风险。因此，近年来，全球范围内bpa在产品中的使用和添加逐步被限制，以规避bpa暴露健康危害。因此，bpa逐步被其他替代物（bps）取代，以生产“无bpa产品”。

2、bpa是一类典型代谢干扰物，其与能量、脂质、氨基酸和核酸代谢的紊乱，以及肥胖和2型糖尿病等代谢疾病相关。bps（双酚af（bpaf）、双酚b（bpb）和双酚ap（bpap））在化学结构上与bpa非常相似，也可能会造成显著的代谢干扰。识别与暴露和效应相关的特定代谢生物标志物有助于揭示环境污染物的共有毒性机制。然而，目前与bps代谢生物标志物识别相关研究较少，主要集中于细胞研究上，缺乏哺乳动物的数据。代谢组学因具备高通量识别生物样本中代谢标志物的优势，逐渐成为环境毒理学研究中筛选环境污染物作用靶点并揭示其作用方式的重要技术手段。然而，目前研究主要聚焦于单一非靶向代谢组学手段，这种方法主要检测丰度较高的代谢物，难以捕获微量代谢物。靶向代谢组学因具备高选择性从而能实现微量代谢物的灵敏和特异检测。非靶向和靶向代谢组学联合分析能提高代谢物识别的覆盖范围和灵敏度，为全面表征微量和高丰度代谢标志物提供了一种有前景的策略。

3、目前bps大多未被进行系统的毒性评估就被推向市场使用，市场更是对这些新型bps缺乏监管，也缺乏有序测试和监管手段。某些bps在哺乳动物的生物样本中检出的浓度水平与bpa相当，并展现出与bpa相当或更甚的毒性，从而引发了广泛的关注。面对快速增长的bps组分，传统的毒理学测试因耗费时间长、测试成本高、动物伦理难以规避等问题，难以满足bps暴露健康风险评估的需求, 迫需开发有效的快速毒性评估工具。通过识别bps暴露诱导的共有分子特征从而构建bps暴露毒性预测工具是一种可行的方法。

技术实现思路

1、传统毒理学测试因耗费时间长、测试成本高、动物伦理难以规避等问题而无法满足快速增长的bps暴露健康风险评估需求，为此，本发明的目的旨在提供双酚类物质暴露的内源标志物及评估暴露毒性效应的方法，实现双酚a替代品暴露毒性效应的快速判别，该方法无需进行大规模的动物实验和毒理学指标检测，利用生物标志物检测含量即可快速评估。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、一种筛选双酚类物质暴露的内源标志物的方法，包括以下步骤：

4、（1）动物染毒暴露及血清获取：将实验动物灌胃给与双酚类物质，暴露（给药）浓度50～400 mg/kg/day，暴露时间15天以上；暴露结束后，获取实验动物血清，净化血清，获得分析样品；

5、所述的实验动物包括啮齿类或非啮齿类动物；

6、所述的啮齿类动物优选大鼠和小鼠；

7、所述的非啮齿类动物优选兔、狗、猴，或其他；

8、所述的双酚类物质包括双酚a及其替代品；

9、所述的双酚a替代品包括双酚af（bpaf）、双酚b（bpb）和双酚ap（bpap）；

10、所述的获取实验动物血清，是在暴露结束后，实验动物禁食12小时以上，麻醉，进行腹切以从腹主动脉采集血液，离心以获取血清；

11、（2）非靶向代谢组学分析：使用超高效液相色谱串联四极杆/轨道阱高分辨质谱仪对样品进行分析测定，采集到若干碎片离子图谱；基于软件建立非靶向代谢组学筛查分析流程，包括峰检测、峰对齐、峰提取、峰整合、化合物鉴定和注释、缺失值插补、质量控制校正、背景扣除以及峰面积标准化，对采集到的碎片离子图谱进行分析；针对筛查出的化合物，利用数据库进行鉴定和注释；

12、所述的软件优选compound discoverer 3.3 sp2；

13、所述的数据库包括chemspider、mzvault、mass lists和mzcloud；

14、（3）靶向代谢组学分析：利用超高效液相色谱串联四极杆/轨道阱高分辨质谱仪构建能同时检测多种代谢物的高通量检测方法，基于精确母离子分子质量提取各化合物的色谱峰，利用同位素内标法进行定量分析；

15、其中，氨基酸化合物的线性范围为125~4000 μg/l，碳水化合物和能量代谢物的线性范围为62.5~2000 μg/l，核苷酸的线性范围为54.75~1750 μg/l；

16、（4）双酚类物质暴露对血清代谢物的影响分析：将非靶向代谢组学分析和靶向代谢组学分析鉴定出的代谢物进行合并分析，以评估bps暴露造成的代谢干扰效应，并找出不同暴露组与对照组间的差异性代谢物；以在所有暴露组中均出现的差异性代谢物为双酚类物质暴露的内源标志物；

17、所述的合并分析优选有监督的多变量统计分析方法（如偏最小二乘判别分析（pls-da）），并通过置换检验评估模型是否过拟合，依据单因素方差分析进行差异代谢物的筛选。

18、本发明请求保护组氨酸和/或犬尿氨酸在评估双酚类物质暴露毒性效应中的应用。

19、本发明请求保护组氨酸/犬尿氨酸比率在评估双酚类物质暴露毒性效应中的应用。

20、一种评估双酚类物质暴露毒性效应的方法，包括以下步骤：

21、s1、获取各暴露组的组氨酸/犬尿氨酸比率数据，并分成训练集数据和测试集数据；

22、所述的数据进行自然对数转换和z-score标准化处理，避免原始数据的非正态分布影响模型预测精度或使模型无法收敛；将70%的数据设置为训练集，30%的数据设置为测试集；

23、s2、将训练集数据中的“组氨酸/犬尿氨酸比率”作为输入，将训练集数据中的“是否受双酚类物质暴露”作为输出，对预设神经网络模型进行训练；

24、s3、将测试集数据中的“组氨酸/犬尿氨酸比率”输入至训练后的预设神经网络模型，预测得到“是否受双酚类物质暴露”分类结果；所述“是否受双酚类物质暴露”分类结果包括：正确预测为受双酚类物质暴露的数量，错误预测为受双酚类物质暴露的数量，错误预测为未受双酚类物质暴露的数量，正确预测为未受双酚类物质暴露的数量；

25、s4、根据所述“是否受双酚类物质暴露”分类结果计算评估准确率；

26、s5、通过roc曲线表示所述评估准确率。

27、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

28、1、本发明耦合非靶向和靶向代谢组学手段系统表征痕量和丰度血清代谢物，提高了代谢标志物识别的覆盖范围、确证度和灵敏度，有利于筛查出特异性强、灵敏度高的双酚类物质暴露代谢标志物。

29、2、本发明通过识别不同双酚类物质在不同暴露剂量下诱导的共有分子特征，明确双酚类物质造成暴露毒性效应的潜在靶点，可为双酚类物质毒性评价提供一个高普适性的生物指标。

30、3、本发明发现了组氨酸/犬尿氨酸比率在评估双酚类物质暴露毒性效应中的高特异性和灵敏度，并基于支持向量机机器学习算法构建了可定性预测双酚类物质暴露的分类模型，为实现双酚类物质暴露毒性效应的快速判别提供了可靠的模型工具。