Her2高表达的循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽，尤其涉及一种可以用于富集、 分离和检测人类表皮生长因子受体2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2,HER2) 高表达的循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，CTC)的多肽-磁性纳米颗粒及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是威胁人类的重大疾病之一，侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的 特征之一，肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落，发生上皮-间质转化 (Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)，从而具有流动特性，进入外周血中，就形 成了循环肿瘤细胞（CTC)。因此在外周血中检测到循环肿瘤细胞（CTC)预示着有可能 发生肿瘤转移，另外，美国哈佛医学院的最新研宄表明，原位肿瘤组织能够吸引CTC细胞 再次浸润到原发肿瘤上从而促进肿瘤的生长（可参考K.Pantel等人，Nat.Rev.Clin. Oncol. 2009, 6, 339-351 ;J.Kaiser等人，Science2010, 327, 1072-1074)，因此CTC的高效检 测对于研宄肿瘤转移机制有指导意义，而且可以对指导肿瘤治疗、判断治疗效果、推断预后 提供可靠参考，对监测肿瘤的转移或复发都有非常重要的意义。
[0003] 自1869年澳大利亚医生ThomasAshworth在显微镜下首次从一名男性肿瘤转移 患者的血液里观察到CTC以来，CTC的研宄引起了人们的广泛关注。CTCs在血液中的含量 极少（约几个CTCs/105?107个单个核细胞），人们对CTC的富集检测方法进行了不断的 探宄。这些方法可以分为两类：机械法和免疫分离法（可参考P.Paterlini-Brechot&N. L.Benali,CancerLett. 2007, 253, 180-204)。前者是根据CTC与血液中的白细胞和红细 胞的细胞直径及细胞密度不同，通过过滤或密度梯度离心的方法实现的；后者则主要是利 用CTC表面的一些特异性标记物如：常见的上皮标记物细胞角蛋白（Cytokeratins，CKs)、 上皮细胞粘附分子（EpCAM)、肿瘤胚胎抗原（CarcinoEmbryonicAntigene，CEA)和人类表 皮生长因子受体 2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，HER2)等，通过抗原抗 体特异性结合反应实现CTC与血液中其他细胞的分离（可参考H.Xu等人，Biomaterials 2011，32, 9758-9765 ;S.L.Stott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010,107, 18392-18397 ; S.Nagrath等人，Nature2007,450, 1235-1239 ;A. _E.Saliba等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA2010,107, 14524-14529 ;X.Wang等人，CancerRes. 2011，71，1526-1532)。
[0004] 与机械分离方法相比，免疫分离方法灵敏度高，分离的特异性好。在这些免疫分 析中，EpCAM和CKs是CTC检测的常用表面标志物。然而，由于抗体生产成本及生产技术 的限制，导致这种基于抗体检测CTC的技术成本较高，如CellSearch检测一个血样需要约 600美元，因此寻找能与CTC特异性靶向结合的新型化合物有重要的意义。近年来，研宄 者们在利用多肽进行肿瘤细胞的识别，靶向肿瘤细胞表面方面展开了广泛的研宄，人们已 经从天然及合成的多肽中筛选出大量能分别靶向不同肿瘤细胞不同作用位点的多肽化合 物（可参考M.Shadidi&M.Sioud，FASEBJ. 2003,17, 256-258 ;M.Shadidi&M.Sioud，Drug Resist.Updates2003,6, 363-371)。在本课题组的前期工作中，已针对EpCAM设计了一系 列多肽，从低于30条的多肽库中，筛选出了靶向EpCAM的特异性识别多肽。以此特异性识别 多肽为探针，将其修饰到磁性纳米颗粒表面，利用磁性富集技术成功实现血液体系中人乳 腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3细胞）的富集，且富集率与抗体一致（Bai，L. ;Du，Y. ;Peng，J.; Yang,Y.etal.J.Mater.Chem.B, 2014, 2, 4080 - 4088) 〇
[0005] 然而，也有研宄表明，因为CTC经历了一系列的EMT转化过程，CTC表面的上皮特 性的分子标志物（例如EpCAM和CK等）可能会发生丢失。所以这种基于常见特异性标志 物的CTC检测方法会漏掉一些CTC亚型，造成CTC检测的假阴性。除了这两种常见的表面 标记物以外，HER2蛋白由于其在肿瘤分型上的特殊作用也成为了一种重要的标记物。研宄 发现乳腺癌（20?35% )和卵巢癌（8?11% )这两大恶性肿瘤细胞高表达HER2蛋白，且 预后较差，严重影响患者的健康和生命。J1ER2蛋白是一种跨膜受体蛋白，表现酪氨酸激酶 活性，分子量为185kD，由原癌基因HER2编码，是表皮生长因子受体（EGFRs)家族的成员之 〇
[0006] 因此，寻找一种HER2高表达的循环肿瘤细胞的多肽及其复合物用于富集、分离和 快速检测循环肿瘤细胞是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一是提供一种能够特异性识别循环肿瘤细胞（CTC)的多肽片段 替代现有的抗-循环肿瘤细胞抗体，从而降低检测成本；本发明的另一个目的是结合现有 的纳米技术，将该特异性识别多肽与磁性纳米颗粒偶联，即提供一种多肽-磁性纳米颗粒， 提高对血液中稀少循环肿瘤细胞（CTC)的检测效率。本发明的又一个目的是提供该特异性 识别多肽-磁性纳米颗粒在制备用于检测肿瘤的转移或复发肿瘤治疗效果评价药物或产 品方面的应用。
[0008] 为达到此发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 第一方面，本发明提供了一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，所述多肽的 氨基酸序列选自SEQIDNO: 1-SEQIDNO: 18之一所示的氨基酸序列。
[0010] 优选地，所述多肽的氨基酸序列选自如下SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0011] GRQLFDNPDQALLDTANDG
[0012] 本发明所述的多肽可通过特异性结合细胞人表皮生长因子受体2(Human EpidermalGrowthFactorReceptor2,HER2)识别循环肿瘤细胞。
[0013] 第二方面，本发明还提供了一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米 颗粒，所述的多肽_磁性纳米颗粒含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的如本发明第一方面所 述的多肽。
[0014] 优选地，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01:5?4:5,例如可以是0.01:5， 0? 05:5,1:5,1. 2:5,1. 5:5,1. 8:5, 2:5, 2. 2:5, 2. 5:5, 2. 8:5,3:5, 3. 2:5, 3. 5:5, 3. 8:5,4:5， 优选为1:5?3:5。
[0015] 优选地，所述的磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
[0016] 优选地，所述磁性纳米颗粒的粒径为150_250nm，例如可以是150nm、180nm、 200nm、220nm、250nm，优选为 200nm。
[0017] 第三方面，本发明还提供了一种如本发明第二方面所述的多肽-磁性纳米颗粒的 制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0018] (1)制备如本发明第一方面所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽；
[0019] (2)将步骤（1)中的多肽制成生物素修饰的多肽溶液；
[0020] (3)将磁性纳米颗粒溶于缓冲液中制成溶液；
[0021] (4)将步骤（2)中生物素修饰的多肽溶液与步骤（3)的磁性纳米颗粒溶液混合后， 混匀，将所述的多肽偶联到所述的磁性纳米颗粒表面，即得。
[0022] 本发明中，步骤（3)还包括将磁性纳米颗粒溶液通过超声或涡旋的方法进行分散 的步骤。
[0023] 本发明中，所述的磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
[0024] 本发明中，步骤（4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液以 0? 01:5-4:5 的质量比混合，例如可以是 0? 01:5,0? 05:5,1:5,1. 2:5,1. 5:5,1. 8:5, 2:5， 2. 2:5, 2. 5:5, 2. 8:5, 3:5, 3. 2:5, 3. 5:5, 3. 8:5,4:5,优选为 1:5 ?3:5。
[0025] 本发明中，步骤（4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液在4-37°C混 合0. 5-2h;优选为于20-30°C混合10min-2h;进一步优选为于25-28°C混合30-40min。
[0026] 本发明中，步骤（4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液于恒温摇 床上混合；优选地，所述的混合于4°C的恒温摇床上混合；优选地，所述恒温摇床的转速为 100_200rpm，优选为 150rpm。
[0027] 第四方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的多肽或如第二方面所述 的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品中的应用。
[0028] 优选地，所述产品为试剂盒或试剂。
[0029] 第五方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的多肽或如第二方面所述 的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中的应用。
[0030] 优选地，所述肿瘤转移相关疾病为人类表皮生长因子受体2 (HER2)高表达相关的 肿瘤。
[0031] 更优选地，所述人类表皮生长因子受体2高表达相关的肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、 肺腺癌、肾细胞癌和前列腺癌。
[0032] 本发明设计了一系列多肽片段，通过筛选得到了本发明的具有特异性识别HER2 特异性的多肽片段；本发明利用生物素-链亲和素的强相互作用，将生物素修饰的特异 性识别多肽与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒偶联，用荧光显微镜观察了修饰FITC-多 肽-Biot