r>[0128] 下面在实施例部分给出关于本发明的方法应用于阿托品的更详细说明。
[0129] 在一优选实施方案中，在严格控制的温度即从37°C到-37°C再回到37°C时，基于 光源和检测器的恒定谐振实施上述的本发明的方法。
[0130] 这种方法允许鉴定用于感兴趣的受体并因此参与药物研宄和研发过程的配体。
[0131] 详细说明所有实施例和附图，以解释本发明和其数个步骤。它们不限制本发明的 范围。 实施例
[0132] 下文中使用的所有化学物质采购自SigmaAldrich?。在改良版的具有红外采样 能力的Cary 5000双采样分光光度计上进行光谱分析。材料是在250nm下激发的单色仪 UV-Vis 1200线/mm和在800nm下激发的NIR(近红外）800线/mm，是检测器NIR冷却的 InGaAs (砷化镓铟）。
[0133] 1)膜制备
[0134] 死后的人脑或从雄性威斯塔鼠（Wistar rat)分离的小鼠全脑，立即转移到冰的 TRIS-EDTA缓冲液中。在液氮中和4°C分别进行3个连续快速冻结和融解循环之前，按同样 的方式对全脑或小脑、海马体、下丘脑/丘脑、新皮层、前额皮质和纹状体分别进行均质。其 后于4°C以6500xg离心20分钟。使用BCA蛋白分析方法测定总蛋白质浓度，储存在-20°C 下待用。每个部分仅融解一次用于每个实验系列。
[0135] 2)动态光谱
[0136] 在所有不同条件中进行所有实验，与溶剂或参比分子比较。从空白（溶剂）和参 比分子减去呈现的图表。
[0137] 对于稀释实验，总分离蛋白使用的浓度为1(T3、1(T6和l(K 9mg/ml。对于不同脑结 构的实验，样品稀释为l〇_6mg/ml。对于使用测试分子的实验，样品使用的浓度为l(T 6mg/ ml。所有实验均在体积为110 yl时进行。样品缓冲液构成空白。对于使用测试分子的实 验，将10 y 1终浓度为1 y M的阿托品和硫双酚二氯加入测试样品中。空白由样品缓冲液中 lyM的测试分子组成。简言之，上述浓度和体积的总蛋白以及空白在-37°C急速冷冻。在 900-1410nm之间进行动态频谱样品的采样，每个样品进行35秒，从-37°C逐渐到37°C，根据 实验设定，以7或10度为增加的温度间隔。
[0138] 3)结果
[0139] 图2-10中示出3种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物蛋白质构象中的动态变化。
[0140] 在图2中，1340nm的吸收峰显示不同蛋白质浓度之间没有差异。全部吸收光谱是 相同的，表明在正常生理温度下，各种条件之间的分子指纹图谱差异不显著。
[0141] 在图3中，与图2相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式不 同。尽管D2的吸收光谱在1200-1350nm之间保持最高，与溶剂和D3相比，D1中后者发生 在1350-1400nm之间。该现象在1200-1300nm时相反（reversed)。这些变化表明与图2相 比，水分子按浓度和温度依赖方式设置。这意味着近红外（NIR)区的水吸收受蛋白质浓度 的影响，其中在Dl、D2和D3之间其动态是显著的。
[0142] 在图4中，与图3相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式不 同。尽管D2的吸收光谱在1250-1400nm保持最高（与图3的1200-1350nm相比），D1中后 者与溶剂相比发生在1380-1400nm之间，与D3相比发生在1200-1350nm之间。D1的吸光率 在1350-1400nm间相对高于溶剂，在1200-1350nm间相对低于溶剂。这些变化表明（与图 2和图3相比）水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。这意味着NIR区的 水吸收受蛋白质浓度的影响，其中在D1、D2和D3之间其动态是显著的。
[0143] 在图5中，与图3和图4相比，蛋白质指纹图谱的全部光谱的浓度和温度依赖方式 不同。尽管D2的吸收光谱相对于D1和D3在1200-1400nm(与图4的1350-1400nm相比） 保持最高，其保持低于溶剂的吸收光谱。这些变化表明（与图2-4相比）水分子按浓度和 温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。这些差异还随着温度升高而减小。这意味着NIR区 的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，图2-5中在D1、D2和D3之间其是显著的。
[0144] 在图6中，与图3-5相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式 不同。尽管在1200-1400nm之间（与图4的1350-1400nm相比），D2的吸收光谱相对于溶 剂、D1和D3在1300-1400nm之间是最低的，但其在1200-1250nm之间保持最高。这些变化 表明（与图2-5相比）水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。随温度升高 这些差异更为显著。这意味着NIR区中的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如 图2-5中Dl、D2和D3之间所示。
[0145] 在图7中，与图3-6相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式 不同。其形态保持相似。与溶剂、D1和D2相比，D3的吸收光谱在1200-1400nm之间最低。 D1的吸收光谱最高，并且随波长从1450降低至1200nm而升高。这些变化表明（与图2-6 相比）水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。随温度升高，这些光谱形态 的差异和演变更为显著。这意味着NIR区中的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影 响，如图2-6中D1、D2和D3之间所示。
[0146] 在图8中，对于溶剂和D1，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱没有差异。在 1200-1450nm之间，溶剂、D1和D2、D3之间成对地存在明显差异与在1350nm的相比，D2和 D3的吸光率在1200nm时都更高。看起来与图3-7相比，这两个独立的吸光率变化，特别是 对于D3,是温度依赖型的。这些变化表明（与图2-7相比）水分子按浓度和温度依赖方式 设置在蛋白质分子周围。随温度升高，这些光谱形态的差异和演变更为显著。这意味着NIR 区中的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如图2-6中D1、D2和D3之间所示。
[0147] 图9示出还未完全返回至基线。对于溶剂、D1和D3,蛋白质指纹图谱的全部吸收 光谱没有差异（1200-1450nm)。虽然D2的光谱形态与其它的相似，但在1200-1350nm之间 的基线返回似乎被延迟或改变了。此时，温度变化和该特定浓度的蛋白质的存在的组合阻 止水分子回到其原始状态。它们不可逆地改变了位置，从而改变其在NIR波长下的吸光率。 这意味着NIR波长下的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如图2-6中Dl、D2和 D3之间所示。
[0148] 图10示出根据温度变化即从37°C到-37°C再回到-37°C的蛋白组装体的光谱演 变。该光谱形态随温度变化而变化。这是由于蛋白质周围的水分子分别在每一温度中的重 排和相互作用导致的。这意味着水分子的吸收导致蛋白质不同构象的固态指纹图谱（solid fingerprint)〇
[0149] 如所见，蛋白质构象变化取决于蛋白质浓度和温度。当示出从_37°C到37°C示出 的温度光谱演变时，就这点而言，图10中的差异更为显著。
[0150] 图11示出存在干扰蛋白质组装体的硫双二氯酚时大鼠下丘脑提取物的结果。硫 双二氯酚改变了蛋白质构象，从而其也改变了 NIR波长内的水分子光谱。注意到与图3相 比，后者在_37°C时变化最大。其返回基线快速。这意味着硫双二氯酚引起的构象变化在低 温时是可见的，并且随着温度升高是可逆的。如图11所示，硫双二氯酚干扰蛋白质组装体， 蛋白质构象方式适合存在的水分子，并因此得到特征指纹图谱。
[0151] 图12示出37°C下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。在存在阿托 品时不同脑结构的光谱形态虽然按照相同的趋势但并不相似。来自顶叶的蛋白质的吸收光 谱与其余的相比在900-1000nm之间更高。该差异不具结论性。这意味着不同人脑结构之 间的水分子的初始重排是不可比的，在37°C下也不足以被注意到。
[0152] 图13示出-37°C下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。存在阿托品 时不同人脑结构的吸收光谱之间有巨大差异。小脑蛋白质周围的水分子在1100_1400nm之 间吸收较少，其中顶叶蛋白质周围的水分子吸收最多。不同脑结构中的水分子排列不同，预 告着其结构和功能不同。后者有利于分子构象指纹图谱和其在人类中的对应生理作用。这 意味着与图12相比，由于温度的变化，可观察到指纹图谱。
[0153] 存在阿托品时不同人脑结构中的蛋白质组装体不一样。虽然在37°C时，这些差异 不显著，但其在_37°C时显著不同（图12和13)。所述变化全按组织依赖型方式遵循其特 定动态模式（图14和15)。
[0154] 图14示出_7°C下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。如通过水分 子NIR光谱所见的，小脑蛋白质构象变化。其在1250-1400nm之间最高。相反，存在阿托品 时，海马体蛋白质对水重排的影响与来自小脑的相反，因为其在相同波长范围内吸收更少。 这意味着由于水分子吸光率的变化，可研宄来自不同结构的蛋白质由于药物的存在引起的 细微构象变化。
[0155] 图15示出7°C下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。存在阿托品 时，如通过水分子NIR光谱所见的，小脑