用于提高辅助受精中的着床成功率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于确定女性受试者在子宫着床窗期间的子宫容受性特征的方 法，从而确定用于所述受试者的个性化治疗以提高着床成功率。
【背景技术】
[0002] 辅助受精，如体外受精（IVF)在三十年来已经被成功用于有不孕问题的人类受试 者。尽管进行了广泛的研宄，但它仍是一种困难且昂贵的程序。实际上，所采集的卵母细胞 中不到5%以及所移植的胚胎中仅有20% -25%得以诞生。胚胎能力以及相应的子宫容受 性的优化是提高辅助生殖技术（ART)成功率的绝对要求。着床的成功牵涉到容受性子宫内 膜与功能性胚泡之间的同步串扰。这种现象只能够在着床窗期间发生，所述着床窗是跨越 月经周期（女性）的第19天与第23天之间的自限性子宫内膜容受期。在正常的月经周期 中，这是经由卵巢雌激素和孕酮的局部作用来实现的，其诱导子宫内膜中的一系列细胞事 件和分子事件，进而产生适当的子宫内膜容受性。
[0003] 用于确定子宫内膜容受性的方法已在本领域中公开：例如，US7, 175, 990公开了 一种基于测定由子宫上皮细胞产生的L-选择素水平的方法，其中L-选择素水平与对照水 平相比升高则表示着床的成功概率提高。EP2348318中公开的另一种用于确定子宫内膜 容受性的方法是基于测定子宫内膜液中前列腺素 E2或F2a的水平。其它新兴的方法， 如子宫内膜容受性阵列（ERA系统）研宄了在着床窗期间特异性表达的238种基因（PCT/ ES2009/000386)。这些方法只可用于确定子宫内膜对胚胎着床的容受性。
[0004] 然而，在确定出子宫内膜不适当的容受性的情况下，这些方法对于恢复子宫内膜 容受性不起帮助作用。
[0005] 本申请的发明人已观测到子宫内膜不适当的容受性可以由以下两种不同的状态 来解释：欠激活状态或过度激活状态。对子宫内膜状态进行确定，由此允许解释它的非容受 性，从而产生适合的并且个性化的治疗以恢复容受性状态。
[0006] 因此，感兴趣的是提供一种允许确定女性受试者的子宫内膜状态的方法，这一信 息可用于对她的治疗进行优化以恢复子宫内膜容受性。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容 受性特征的方法，所述方法包括：
[0008] 在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜的状态：
[0009] a)子宫NK(uNK)细胞的活性状态的生物标志物，以及
[0010] b)子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，
[0011] 将所述值与参考值进行比较，
[0012] 从而确定子宫内膜的状态，所述子宫内膜的状态表明适当的或不适当的子宫容受 性。
[0013] 在一个实施方案中，通过测量IL-18、IL-6以及IL-12表达中的至少一种来确定 uNK细胞的活性状态。
[0014] 在另一个实施方案中，通过测量IL-18和Tweak表达并且计算IL-18/Tweak比率 来确定uNK细胞的活性状态。
[0015] 在另一个实施方案中，通过对⑶56+uNK细胞的数目进行定量或通过测量⑶56表 达来确定uNK细胞的募集。
[0016] 在另一个实施方案中，通过测量IL-15表达来确定uNK细胞的成熟状态。
[0017] 在另一个实施方案中，通过测量IL-15和FnH表达并且计算IL-15/Fnl4比率来 确定uNK细胞的成熟状态。
[0018] 在另一个实施方案中，所述参考值是从有生育能力的女性受试者获得的。
[0019] 本发明的另一个目的在于一种子宫容受性特征，所述子宫容受性特征是基于对以 下各项特异的生物标志物进行定量：a)uNK细胞的活性状态；以及b)uNK细胞的募集和成熟 状态。
[0020] 在一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于以下各项的表达：a) IL-18、IL-6 以及IL-12中的至少一种；以及b)⑶56和IL-15。
[0021] 在另一个实施方案中，所述子宫容受性特征是通过如本文以上所述的方法获得 的。
[0022] 本发明的另一个目的在于一种用于提高女性受试者的辅助生殖技术（ART)程序 的成功率的方法，所述方法包括：
[0023] 如本文以上所述确定所述受试者在子宫着床窗期间的子宫容受性特征，以及
[0024] 根据所观测到的所述子宫容受性特征，确定针对所述受试者的个性化建议。
[0025] 本发明的另一个目的在于一种用于针对辅助生殖技术（ART)程序对女性受试者 进行评估的方法，所述方法包括：
[0026] -从所述女性受试者获得信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项 信息均与预先选择的受试者变量有关，其中所述变量中的一种是如本文以上所述的子宫容 受性特征，
[0027] -使用基于所述预先选择的受试者变量的算法将针对所述女性受试者的所述特征 与已知表示对辅助生殖技术程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较，
[0028] -其中所述比较针对ART程序提供对所述女性受试者的评估。
[0029] 在一个实施方案中，所述预先选择的受试者变量包括组织学分期（histological datation)(确定容受窗）；子宫内膜特征（如子宫内膜厚度、子宫内膜容积、子宫内膜血管 形成、子宫动脉多普勒）；年龄；不孕的病因；不孕的数据，如先前病史以及移植胚胎的数目 和质量的汇总；对卵巢储备的激素评估（AMH、FSH、窦状卵泡计数）；ART的类型（IVF、ICSI、 頂SI、授精）。
[0030] 本发明的另一个目的在于一种用于在针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行 评估中分析数据的系统，所述系统包括：
[0031] -计算环境，
[0032] -输入装置，所述输入装置与计算环境连接以从用户接收数据，其中所接收的数 据包含来自女性受试者的信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项信息均与 预先选择的受试者变量有关，其中所述变量中的一种是如本文以上所定义的子宫容受性特 征，
[0033] -输出装置，所述输出装置与所述计算环境连接以向所述用户提供信息，以及
[0034] -计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上已存储有至少一种算法以将 针对所述女性受试者的所述特征与已知表示对辅助生殖技术程序有响应性的已知特征模 式的文库进行比较，其中所述系统提供结果，所述结果可以用于生成在针对辅助生殖技术 程序对女性受试者进行评估中提供数据分析的报告。
[0035] 在一个实施方案中，所述预先选择的受试者变量包括组织学分期（确定容受窗）； 子宫内膜特征（如子宫内膜厚度、子宫内膜容积、子宫内膜血管形成、子宫动脉多普勒）；年 龄；不孕的病因；不孕的数据，如先前病史以及移植胚胎的数目和质量的汇总；卵巢储备的 激素评估（AMH、FSH、窦状卵泡计数）；ART的类型（IVF、ICSI、MSI、授精）。
[0036] 本发明的另一个目的在于一种用于实施如本文以上所定义的方法的试剂盒，所述 试剂盒包含：
[0037] -用于测量IL-18、IL-6、IL-12中的至少一种的表达以及IL-15和CD56的表达的 试剂，
[0038] -任选的用于测量Tweak和Fn-14的表达的试剂，
[0039] -任选的用于测量GCSF-R的表达的试剂，
[0040]-任选的用于测量参考基因的表达的试剂，以及
[0041] -用于实施如本文以上所定义的方法的说明书。
[0042] 定义
[0043] 在本发明中，以下术语具有以下含义：
[0044]-术语"辅助生殖"指的是用于提高人类或动物的生育力的临床技术和实验室技 术，包括但不限于体外受精（IVF)、冷冻胚胎移植（FET)、胞浆内精子注射（ICSI)、胞浆内形 态选择精子注射（MSI)、配子输卵管内移植（GIFT)、子宫内授精（IUI)以及合子输卵管内 移植（ZIFT)。
[0045] -术语"着床失败"指的是通过辅助生殖或经由人工授精产生的几个胚胎未能在接 受者受试者的子宫中着床或正常着床。胚胎着床失败病例的实例包括但不限于8胚胎移植 后着床失败、4胚胎移植后着床失败、在J5时2胚胎移植后着床失败、或外源性卵母细胞捐 赠后移植2个胚胎后着床失败。在一个实施方案中，定义着床失败的被移植而后续着床失 败的胚胎的最小量是在第2天或第3天具有最佳形态的至少四个胚胎、在第2天或第3天 具有中等形态的六个胚胎或在第5天的2个胚胎。
[0046] -术语"卵巢功能不全"指的是年龄小于40岁的女性中卵巢功能丧失。患有这种 病症的受试者还表现出对胚胎的生理性排斥反应。这些病症包括但不限于：卵巢早衰、高促 性腺素性功能减退症、性腺发育不全、过早绝经、或早停经。
[0047] -术语"子宫着床窗"指的是在排卵后约4至5天时开始并且持续约4天的非常 短的一段时间。这种被定义为着床窗的窗限定了月经周期中子宫对胚胎具有容受性的时间 段。在中期黄体期的期间，为成功妊娠所需的子宫重塑事件在着床之前起始于子宫内膜的 蜕膜化，所述子宫内膜的蜕膜化甚至在人体内不存在受精了的孕体的情况下也会发生。
[0048] -术语"受试者"指的是哺乳动物，优选地雌性哺乳动物，更优选地女性人类。在一 个实施方案中，所述受试者指的是经历着床失败的女性。在另一个实施方案中，所述受试者 指的是患有卵巢功能不全的女性。
[0049] -如本文所用的术语"参考值"广泛地涵盖可被用作基准以相对于测量变量进行比 较的任何合适的值。优选地，所述参考值是从有生育能力的女性受试者获得的。
[0050] -术语"表达"可互换地指基因的表达，所述表达包括所述基因的转录物、mRNA、这 些RNA转录物的多肽翻译产物，无论是否对这种产物进行转录后修饰；或基因产物的表达， 所述基因产物包括编码的多肽或蛋白质。基因产物的表达可例如通过使用一种或多种与多 肽结合的抗体进行免疫测定法来测定。或者，基因的表达可通过例如以RT-PCR、qPCR测量 mRNA水平来测定。
[0051] -术语"归一化的水平"指的是相对于参考基因表达水平的基因表达水平。
【具体实施方式】
[0052] 如实施例中所示，当仅利用以下各项中一项的测定时，所检查的女性中有超过 40%被分类为呈现出正常的子宫内膜状态或适当的子宫容受性特征：（1)子宫NK细胞或细 胞因子子宫内膜环境的活性状态；（2)子宫NK细胞的成熟状态；或（3)子宫NK细胞的募集 状态。
[0053] 当实施本发明的方法时，本申请的发明人已发现在如通过仅利用子宫NK细胞或 细胞因子子宫内膜环境的活性状态的测定所确定的、被分类为呈现出正常的子宫内膜的 42%的受试者当中，有几乎25%实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
[0054] 此外，在如通过仅利用子宫NK细胞的成熟状态的测定所确定的、被分类为呈现出 正常的子宫内膜的43%的受试者当中，有几乎75%实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
[0055] 此外，在如通过仅利用子宫NK细胞的募集状态的测定所确定的、被分类为呈现出 正常的子宫内膜的47 %的受试者当中，有80 %实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
[0056] 因此需要一种允许更准确地确定子宫内膜状态的方法，从而允许原本会被认为 "正常"的女性得益于个性化的并且优化的治疗以恢复子宫内膜容受性并且因此提高她们 获得发展性妊娠 （evolutive pregnancy)或活产的机会。
[0057] 本发明旨在通过确定子宫内膜的状态来确定子宫/子宫内膜的容受性以对治疗 进行优化以恢复子宫容受性。
[0058] 本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容 受性特征的方法，所述方法包括：
[0059] 在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜的状态：
[0060] a)子宫自然杀伤（UNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物， 以及
[0061] b)子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，
[0062] 将所述值与参考值进行比较，
[0063] 从而确定子宫内膜的状态，所述子宫内膜的状态表明适当的或不适当的子宫容受 性。
[0064] 将受试者的子宫内膜状态区分成以下三种特定的状态：（1)欠激活状态、（2)正常 状态、以及（3)过度激活状态，允许将受试者分成两个类别：适当的子宫容受性（正常的子 宫内膜状态）和不适当的子宫容受性，后者被分成两个亚类：不存在容受性（欠激活的子宫 内膜状态）和异常的容受性（过度激活的子宫内膜状态）。
[0065] 将受试者区分成这三个类别，由此允许对她们的治疗进行监测以恢复适当的子宫 内膜容受性，从而提高成功率并且对ART程序进行优化。
[0066] 因此，本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子 宫容受性特征的方法，所述方法包括：
[0067] 在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜状态：
[0068] a)子宫自然杀伤（UNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物，
[0069] b)子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，以及
[0070] c)将所述值与参考值进行比较，
[0071] 从而将受试者的子宫内膜状态区分成以下三种特定的状态：（1)欠激活状态、（2) 正常状态、以及（3)过度激活状态，这允许将受试者分成两个类别：适当的子宫容受性（正 常的子宫内膜状态）和不适当的子宫容受性，后者被分成两个亚类：不存在容受性（欠激活 的子宫内膜状态）和异常的容受性（过度激活的子宫内膜状态）。
[0072] 在一个实施方案中，所述子宫内膜样品是子宫内膜活检。
[0073] 如本文所用的uNK细胞的活性状态指的是在周围的子宫内膜细胞上的外部uNK细 胞的活性状态。
[0074] 如本文所用的细胞因子子宫内膜环境的活性状态指的是在周围的子宫内膜细胞 上的免疫细胞的活性状态。
[0075] 在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的活性状态或细胞因子子宫内膜环境的活 性状态是通过测量以下生物标志物中的至少一种的表达水平来确定的：IL_18、IL-6以及 IL-12〇
[0076] 在一个实施方案中，IL-18、IL_6或IL-12的表达水平可以通过估算蛋白质的量或 对应于编码IL-18、IL-6或IL-12的基因的核酸的量（例如像RNA的量）来测量。在一个 实施方案中，可以相对于参考基因产物的水平将所述水平归一化，所述参考基因产物例如 像RPL-13A、β-2微球蛋白或tata盒蛋白TBP。在另一个实施方案中，可以相对于参考基 因的至少两种产物的几何平均水平将所述水平归一化。在另一个实施方案中，所述参考基 因不是肌动蛋白和GAPDH。
[0077] 如本文所用的术语"IL-6"指的是白细胞介素6 ;术语"IL-12"指的是白细胞介素 12并且术语IL-18指的是白细胞介素18。
[0078] 用于测量样品中IL-6、IL-12或IL-18的表达水平的方法