一种快速酶解糖化白蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质酶解技术领域，尤其涉及一种快速酶解糖化白蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 糖化血清白蛋白（GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的产物，即血清白蛋白的 赖氨酸残基上的e-氨基基团被糖化。糖化白蛋白半衰期较短，测定糖化白蛋白的浓度可 有效反映患者过去2?3周内平均血糖的水平，并不受临时血糖浓度波动的影响。目前， 临床广泛采用果糖氨基酸氧化酶（FA0D)法测定GA含量，该法在测定GA时，需要先用蛋白 酶将糖化白蛋白酶解为糖化氨基酸，然后用特异性的果糖氨基酸氧化酶进行氧化，再偶联 Trinder's反应进行显色定量。已有的研究表明，用单纯的蛋白酶体系进行糖化白蛋白的 酶解反应，需要数十分钟甚至数小时才能将高浓度的糖化白蛋白酶解完全，而应用于全自 动生化分析仪的FA0D检测法通常要求GA的酶解效率在180-600秒内达到90%以上。为了 达到此技术要求，现有的技术常采用加大蛋白酶浓度或加入高浓度的蛋白变性剂加快酶解 反应的速度。采用加大蛋白酶浓度的酶解方法不仅增加了检测成本，而且使测定试剂的粘 度增加从而对测定造成不利影响；加入高浓度蛋白变性剂的方法虽然加快了糖化白蛋白的 酶解速度，但使蛋白酶的存储稳定性降低，对试剂的有效期产生不利影响。
[0003] 因此，需求一种可在180-600秒内快速酶解糖化白蛋白、使酶解效率达到90%以 上的方法，对于实现FA0D法测定GA含量显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种快速酶解糖化白蛋白的方法，该方法通过在含有低浓度 蛋白酶和蛋白变性剂的酶解液中添加一定浓度的离子液体用于提高蛋白酶的活性和稳定 性，实现在180-600秒内将糖化白蛋白快速酶解，特别适合FA0D法测定糖化白蛋白的方法 学及测定试剂开发。
[0005] 本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明的快速酶解糖化白蛋白的方法的具体步骤如下：
[0007](1)配制含有离子液体、蛋白变性剂、蛋白酶K、CaCl2、聚乙二醇6000、TritonX-100、叠氮钠的pH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液；
[0008] (2)加入用HPLC法准确定值的糖化白蛋白样品液，在35-40°C水浴中反应180-600 秒；
[0009] (3)向步骤⑵所得的溶液中加入EDTA? 2Na溶液，终止酶解反应；
[0010] ⑷用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率。
[0011] 步骤⑴中，所述的离子液体为1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐。
[0012] 步骤（1)中，所述的蛋白变性剂为十二烷基磺酸钠。
[0013]步骤（1)中，所述的pH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为 20-200mmol/ L，含有的离子液体浓度为0. 5-5g/L、蛋白变性剂浓度为5-25mmol/L、蛋白酶K浓度为 5-15KU/L、CaCl2浓度为 2-20mmol/L、聚乙二醇 6000 浓度为 10-50g/L、TritonX-100 浓度为 0? 5-10ml/L、叠氮钠为 0? 5-1.Og/L。
[0014] 步骤⑵中，糖化白蛋白样品液的浓度CeA1为300-900iimol/L。
[0015] 步骤（2)中，优选反应条件为在37°C水浴中反应180-600秒。
[0016] 步骤⑵中，糖化白蛋白样品液体积VeA与Tris-HCl缓冲液体积VMs_Ha之比为 Vga:Vms-hci- 5:240。
[0017] 步骤⑶中，EDTA? 2Na溶液浓度为200mmol/L。
[0018] 步骤（3)中，EDTA? 2Na的加入量VEDTA.2Na与步骤⑵中VeA、VMs_Ha的体积比为： ^GA： ^Tris-HCl:VedTA. 2Na- 5:240:60。
[0019] 步骤⑷中，糖化白蛋白酶解率的计算公式为：糖化白蛋白酶解率（％) = {〇^_ [cCA2x(vCA+vMs_HC1+vEDTA.2Na)/vCA]}/cCA1xioo% ;其中CCA1 是步骤⑵中糖化白蛋白样品液 的浓度，CM2是步骤（4)中用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，VM是步骤 ⑵中的糖化白蛋白样品液体积，VMs_HC1是步骤⑴中的pH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液体积， VEDTA.2Na是步骤⑶中EDTA? 2Na溶液的体积。
[0020] 本发明的积极效果如下：
[0021] 本发明的快速酶解糖化白蛋白的方法具有方法简单、方便快捷、易于操作的优点， 并且可在180-600秒内快速酶解糖化白蛋白、使酶解效率达到90 %以上，特别适合FA0D法 测定糖化白蛋白的方法学及测定试剂开发。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0023] 糖化白蛋白样品液的制备：精密称取优级纯糖化白蛋白，用去离子水稀释至糖化 白蛋白浓度为300-900iimol/L。
[0024] 糖化白蛋白酶解率的计算公式为：糖化白蛋白酶解率（％ ) = {CCA1-[CCA2X(VCA+VT mn+VH^.aJ/VcJVC^XlOO%。其中CeA1是步骤⑵中糖化白蛋白样品液的浓度，(：咖是 步骤⑷中用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，VM是步骤⑵中的糖化 白蛋白样品液体积，VMs_Ha是步骤（1)中的pH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液体积，VEDTA.2Na是步 骤⑶中EDTA? 2Na溶液。
[0025] 实施例1
[0026] (1)配制 12mlpH7. 5Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为 20mmol/L，优选的离 子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐的浓度为0. 5g/L，优选的蛋白变性剂十二烷基磺 酸钠的浓度为5mmol/L，蛋白酶K浓度为5KU/L、CaCl2浓度为2mmol/L、聚乙二醇6000浓度 为 10g/L、TritonX-100 浓度为 0? 5ml/L、叠氮钠为 0? 5g/L;
[0027] (2)加入用HPLC法准确定值的300iimol/L糖化白蛋白样品液0? 25ml，37°C水浴 中反应180秒；
[0028] (3)向步骤⑵所得的溶液中加入浓度为200mmol/L的EDTA，2Na溶液3ml，终止 酶解反应；
[0029] (4)用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率 为 98. 6%。
[0030] 可以看出，用本实施例所述方法在酶解300iimol/L糖化白蛋白样品液180秒时酶 解效率已经达到90%以上。
[0031] 实施例2
[0032] (1)配制 12mlpH8.OTris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为 110mmol/L，优选 的离子液体1- 丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐的浓度为2. 7