一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，特别涉及一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法。
【背景技术】
[0002]细胞是生物体的基本结构单位。细胞的生命活动是在内、外环境的动态平衡过程中进行的。细胞和组织遭受不能耐受的有害因子刺激时，则可能引起损伤。较轻的细胞损伤是可逆的，消除刺激因子后，受损伤细胞可恢复常态，通常称之为亚致死性细胞损伤。细胞的严重损伤是不可逆的，最终引起细胞死亡。引发细胞损伤的原因很多，可以归纳为:缺氧、化学物质和药物、物理因素、生物因子、营养失衡、内分泌因素、免疫反应、遗传变异、衰老等若干大类。
[0003]由多种因素引发的细胞损伤，其发生机制复杂。细胞膜的破坏、氧自由基增多、胞浆内高游离钙、缺氧、化学毒作用和遗传物质变异等，对于细胞损伤的发生具有重要意义。这几方面的机制通常是相互结合或是互为因果地导致细胞的损伤。缺氧是诸多致病因素引起细胞损伤的一个非常重要的基本环节。多种原因引发的缺氧最终都导致线粒体氧化磷酸化受抑制，使细胞能量来源三磷酸腺苷(ATP)生成减少，造成细胞膜钠-钾泵、钙泵功能低下和胞浆内蛋白质合成、脂肪代谢障碍等，造成无氧糖酵解过程的活化。酵解会进一步使细胞酸中毒、溶酶体膜破裂、大量降解酶释放形成细胞自身消化。缺氧还可使氧自由基等活性氧类物质增多，膜磷脂丢失，脂质崩解，细胞骨架破坏等。轻度、较短时间缺氧所致的细胞损伤通常是可逆的，严重缺氧或/和较长时间的轻度缺氧所致的细胞损伤是不可逆的，引发细胞坏死。
[0004]包括移植用供体器官在内的某些状态下的组织器官，由于缺氧而造成不可避免的、不同程度的细胞损伤。这些细胞损伤可直接引发误诊、误治:对于器官移植手术来说，移植排斥反应是移植失败的主因，而供体器官的质量下降可以引起超急性排斥反应和慢性排斥反应，因此供体器官质量是移植成败的重要决定因素之一。供体器官质量是由供体来源(活供体、脑死亡供体、死亡供体)、供体健康状况、热缺血时间、灌注保存方法、冷储存时间、运输方式等多种因素综合决定。由于移植医学的特殊性，供体群趋于老龄化、活供体源远远少于需求，因而死亡供体成为主要器官源，使相应的供体器官质量远远无法保障。本应在移植手术前对供体器官的质量进行严格评估，然而，世界上目前除了配型和病毒检测以外，没有对供体器官的质量监控的任何其他手段，只是对供体器官的“保质期”有大致的限定，从而造成相当一部分移植手术因源标本质量问题而失败，即便移植手术成功，受过损伤的供体器官往往也不具备正常器官的功能，使患者不必要的接受一次无意义的手术，无谓地加重病人经济负担、社会保险负担，更重要的是，使病人多承受一次危及生命的手术创伤。
[0005]目前在器官移植以外的科研、医疗领域，对细胞损伤的检测手段主要有:利用细胞缺氧后失去能量合成而致使三磷酸腺苷(ATP)水平下降为原理，对三磷酸腺苷/ 二磷酸腺苷比值(ATP/ADP)的检测。此类以检测氧、养为标准的对细胞损伤的评价方法，由于在常规供体器官采样操作中需要对供体器官进行灌注，而灌注液里含有上述ATP等成份，因而针对上述成份的检测无法在对供体器官质量的评估中使用，类似方法还包括针对细胞损伤后的有害分子一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等成份的细胞损伤评估手段。
[0006]综上所述，目前急需研发一种能够广泛应用于对器官移植中供体器官内细胞损伤进行定量评估的技术方法，以保障移植手术的合理性以及对移植术后效果的预测。
[0007]维持细胞骨架蛋白等基本组成结构的正常功能是保障细胞生存的前提。胞衬蛋白是一种细胞膜骨架蛋白，一个较大的异源二聚体蛋白，由α亚基和β亚基组成，并且具有典型的106个氨基酸构成的被称作α胞衬蛋白重复体的连续基序，在维持细胞膜的稳定、结构及形状中起重要作用。随着对α胞衬蛋白结构与功能地深入研究，人们发现α胞衬蛋白还参与多种生物途径，如细胞粘附及细胞伸展、细胞周期等。更重要的是，从病理学角度出发，骨架蛋白的损伤与细胞膜损伤、溶酶体释放一道是细胞不可逆损伤的三大标志，最终导致细胞核崩解而完全失去生命行为及生理功能。因此，α胞衬蛋白，作为细胞骨架和细胞膜的重要组成部分，是细胞不可逆损伤的评价指标。
[0008]重要的生物分子(例如细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白等)在细胞内执行生命所需的最基本生物功能，因而维持这些重要分子的正常功能是保障细胞生存的前提。此类生物分子上的化学修饰(例如磷酸化、甲基化等)往往决定了该分子能否正常发挥其功能。在细胞损伤早期，存在于这些重要生物分子上的化学修饰随着损伤的加重而发生渐进性改变，从而影响细胞基本生理功能，最终导致细胞死亡。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内共价修饰方式之一(指在蛋白质加入一个磷酸基团，此修饰由于能够反转蛋白的生理功能而在生物化学中占有重要地位)。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体三磷酸腺苷(ATP)的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动，目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化。
【发明内容】
[0009]发明目的:本发明的目的在于提供一种灵敏、准确的早期细胞损伤程度检测方法。
[0010]技术方案:本发明提供的一种细胞损伤程度检测方法，通过检测细胞骨架蛋白的化学修饰变化程度作为评价细胞不可逆损伤早期的损伤程度的参数，即以细胞骨架蛋白发生化学修饰变化的分子数量与细胞骨架蛋白未发生化学修饰变化的分子数量的比值作为评价被检测样品中细胞不可逆损伤的程度的参数。
[0011]通过检测包括细胞骨架蛋白在内的能执行重要细胞生命功能的分子的变化来评价细胞损伤程度，由于该类分子参与细胞骨架、细胞质膜等重要细胞成分的构建，因此该类分子损伤必然造成细胞不可逆损伤。
[0012]作为优选，所述细胞骨架蛋白为α胞衬蛋白。
[0013]作为另一种优选，所述化学修饰包括磷酸化。
[0014]申请人通过大量研究发现，在生物组织和器官失去氧、养供给后的细胞损伤过程中，细胞能量来源减少，造成细胞膜钠-钾泵、钙泵功能低下，细胞膜通透性增加，高浓度钙离子进入细胞内部，导致细胞释放I丐蛋白酶，I丐蛋白酶在Ct胞衬蛋白的薄弱环节(第1176号酪氨酸处)将其降解、切断成两个降解片段。重要的是，降解产物与所剩余的完整α胞衬蛋白的比值(即降解比例)与细胞所受损伤程度呈现极为密切的正相关趋向。
[0015]申请人进一步通过对α胞衬蛋白作为细胞损伤的指示物的研究过程中发现，α胞衬蛋白的第1176号酪氨酸的磷酸化的丧失，使磷酸基团所导致的蛋白构象变化对该薄弱位点的保护作用消失，从而使该位点对钙蛋白酶的易感性增强；相对于α胞衬蛋白被钙蛋白酶切断来说，1176酪氨酸磷酸化的丧失是更为早期的细胞损伤的特征，也成为细胞损伤演变为不可逆行为的开始。更重要的是，细胞内该氨基酸的总体磷酸化水平与细胞损伤程度呈现极为密切的负相关趋向。
[0016]具体而言，细胞在不可逆损伤过程早期发生的病理生理改变(即细胞骨架蛋白α胞衬蛋白在1176号酪氨酸上的去磷酸化过程)如图1所示。图1b显示了细胞可逆性损伤的机制:细胞外游离钙离子11由于细胞膜泵失活、通透性增加而进入细胞内，同时休眠状态的钙蛋白酶12被激活；但由于α胞衬蛋白的磷酸化保护仍然存在，因而被激活状态下的钙蛋白酶15无法接近1176号酪氨酸，无法切割降解α胞衬蛋白。图1c显示了细胞不可逆损伤早期的机制:磷酸基团14从α胞衬蛋白1176号酪氨酸上脱落，钙蛋白酶15在钙离子11的协同下接近1176号酪氨酸，对α胞衬蛋白13进行切割降解。图1d显示了细胞不可逆损伤后期的机制胞