在纳米结构装置上选择性捕获并经刺激释放循环细胞的制作方法
【专利说明】在纳米结构装置上选择性捕获并经刺激释放循环细胞
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年7月31日提交的美国临时申请No. 61/677,825的优先权， 其全部内容均通过引用并入文本。
[0003] 本发明是在国立卫生院授予的资助No. R21CA151159和R33 CA157396的政府支持 下完成的。政府享有本发明的某些权利。
【背景技术】
[0004] 1.技术领域
[0005] 本发明当前要求保护之实施方案的领域涉及用于选择性捕获并经刺激释放循环 细胞的装置和方法。
[0006] 2.相关技术讨论
[0007] 循环肿瘤细胞[1] (circulating tumor cell，CTC)是从原发性肿瘤或转移部位脱 落并作为转移瘤的细胞来源在外周血中循环的癌细胞[2]。目前用于癌症诊断的金标准需要 侵入性活组织检查和随后对活检样品进行的组织病理学分析。然而，在早期转移或复发时， 收集组织活检样品难以确定转移/复发部位。因此，CTC可被认为是肿瘤的"液体活组织检 查"，其能够在致命性转移发生之前方便地获得肿瘤细胞。为了开发CTC作为可报告疾病进 展并指导治疗实施的新癌症"生物标志物"，大量的研宄努力 [3]致力于开发能够检测癌症患 者血液中的CTC并对其进行计数的诊断测定。主要的技术挑战在于从血液样品的大量（IO 9 个细胞/mL)血细胞[4]中有效且特异性地捕获丰度极低（数个至数百个细胞/mL)的CTC。 基于不同的工作机制，在过去几十年中已开发了多种多样的CTC测定。例如，免疫磁性分离 法 [5]利用包被有CTC特异性捕获剂（例如，抗体或适配体）的磁珠来捕获CTC。基于免疫磁 性分离的CellSearch?测定是可预测转移性乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌预后结果的唯 一经FDA批准的CTC计数法。近来，开发了数种基于微芯片的技术 [6]来解决CellSearch ? 测定所遇到的低CTC捕获效率的问题。在此时，越来越多的新CTC测定已证明其对癌症患 者的CTC计数具有极大的灵敏性。为了进一步开发CTC除计数之外的诊断价值，目前的研 宄机构致力于建立CTC的分子和功能分析。可想到的是，CTC来源的分子信号和功能信息 将在治疗性介入可造成显著差异的关键窗口中为肿瘤生物学提供有价值的深入理解。为了 铺平迈向CTC之分子分析和功能分析的道路，迫切需要开发这样的新CTC测定，其不仅可高 效捕获CTC，而且可以在周围白细胞（WBC)的污染最小并且可忽略对CTC存活力和功能产生 的破坏的情况下释放CTC。
【发明内容】
[0008] 根据本发明的一个实施方案，用于从包含多种细胞类型的流体样品中捕获预选细 胞类型的装置包括：基底；多条纳米线（nanowire)，其中至少一条纳米线与基底的表面连 接或与基底的表面成为一体使得多条纳米线中的至少一条纳米线具有未连接端；以及温度 响应性材料层，其形成在多条纳米线中每一条的至少未连接端上。温度响应性材料层在第 一温度下具有紧凑结构并且在第二温度下具有展开结构，以便于使在第一温度下捕获的细 胞在第二温度下释放。
[0009] 根据本发明的一个实施方案，从包含多种细胞类型的流体样品中捕获预选细胞类 型的方法包括：提供温度响应性纳米结构（nanostructured)细胞捕获装置；使样品沉积到 温度响应性纳米结构细胞捕获装置的细胞捕获表面上；改变温度响应性纳米结构细胞捕获 装置的温度以便于移除活的所捕获细胞；以及在从温度响应性纳米结构细胞捕获装置中移 除之后收集所捕获细胞。
【附图说明】
[0010] 考虑到描述、附图和实例，其他目的和优点将变得显而易见。
[0011] 图IA和IB提供了根据本发明一个实施方案的用于从包含多种细胞类型的流体样 品中捕获预选细胞类型的装置的示意图。
[0012] 图2示出了根据本发明一个实施方案的图IA和IB之装置整合到流体芯片中的一 个实例。在该实施方案中，包括具有提高细胞-基底接触频率的蜿蜒混沌混合通道的重叠 聚二甲基硅氧烷（PDMS)。为了进行CTC捕获，将装置设定在37°C。随后，包含CTC的血液样 品流经装置，通道顶上的人字形微图案引起微通道中的垂直流动。因此，CTC与NanoVelcro 基底之间的接触频率增加，导致CTC捕获效率提高。在CTC在被捕获（固定）在纳米结构 基底上后，就可将装置设定为4°C，导致CTC从基底特异性释放。
[0013] 图3是为帮助解释本发明一些实施方案的一些概念的示意性图解。为了在该实施 例中赋予NanoVelcro CTC测定热响应性，将经生物素功能化的聚合物刷（即PIPAAm)共价 接枝到硅纳米线基底（SiNWS)上。在37°C，生物素化PIPAAm的生物素基团和疏水结构域 呈现在生物素-P-SiNWS的表面上。通过生物素-链霉亲和素相互作用，可将生物素化抗 EpCAM引入到生物素-P-SiNWS上，从而实现高效的CTC捕获。当将温度冷却至4°C时，经表 面接枝的生物素化PIPAAm的骨架展开，导致CTC从基底释放。
[0014] 图4A至4C示出了 a)用于将生物素化PIPAAm共价接枝至SiNWS上的合成方法。 通过改变两种单体前体的比例，可将三种不同密度（2. 5%、5%和10% )的生物素基团并入 到所得生物素-P-SiNWS上。b)采用接触角来检验三种生物素-P-SiNWS的热响应性。c) 将抗EpCAM引入到生物素-P-SiNWS上后，不管采用的温度如何，表面都变成亲水的。
[0015] 图5A至提供了将本发明一个实施方案与替代结构进行比较的数据。a)三种 具有不同密度（2. 5%、5%和10% )生物素基团的生物素-P-SiNWS的细胞捕获/释放性 能的定量评价。b)进行/未进行重复抗EpCAM缀合的多轮/连续循环研宄中10%生物 素-P-SiNWS的细胞捕获/释放性能。c)使用三种对照样品进行细胞捕获/释放研宄：（i) PIPAAm-SiNWS、（ii)经抗EpCAM包被的SiNWS和（iii)在平坦的硅芯片上的经抗EpCAM包 被的生物素-P，其与10%生物素-P-SiNWS平行地进行检验。d)使用三种EpCAM阳性癌细 胞系（即MCF7、LnCAP和PC3癌细胞系）、两种EpCAM阴性癌细胞系（即HeLa和Jurkat细 胞系）和新鲜分离的人白细胞对10%生物素-P-SiNWS的一般适用性和特异性进行的定量 评价。
[0016] 图6A至6D提供了以下数据：a)三种不同类型的样品中在不同细胞数（10至1000 细胞ml/ 1)的细胞捕获效率：DMEM培养基（□)和全血（Λ) ;(b)使用经抗EpCAM包被的生 物素-P-SiNWS (白色柱）和SiNWS (黑色柱）进行的MCF7细胞捕获/释放研宄中观察到的 细胞释放性能和所释放细胞的存活力；c)经DiO染色的MCF7细胞在被捕获并从经抗EpCAM 包被的生物素-P-SiNWS释放后得到成功培养。
[0017] 图7A至7D提供了以下数据：a)根据本发明一个实施方案的热响应性NanoVelcro CTC芯片在流率为0. 1、0. 2、0. 5、1、2和5mL IT1时的细胞捕获效率。b)在PBS中评估所捕 获细胞在热响应性NanoVelcro芯片上的分布。大多数（78% ) CTC在前4个通道中被捕获。 c)在37°C和4°C两种温度，在PBS中三种不同的肺癌细胞系（即表达EpCAM的A549、HCC827 和H2228)和对照细胞（即不表达EpCAM的Jurkat、Hela和WBC)的捕获效率。所有的误差 条均表示标准差（η >= 3)。d)在10细胞ml/1至1000细胞mL η的不同掺入细胞数的捕获 效率。
[0018] 图8A至8C提供了以下数据：a)作为流率和洗脱时间之函数的CTC释放性能。由 这些数据确定了根据本发明一个实施方案的最佳条件（流率：〇. lmL/h和洗脱时间：20分 钟）；b)可通过分别在37°C与4°C之间进行多个加热和冷却的循环来提高细胞释放性能。 在4至5个加热和冷却的循环后可获得优异的细胞释放性能。我们注意到，实验数据是通 过在根据本发明一个实施方案的新一代热响应性NanoVelcro CTC芯片中捕获约200个CTC 获得的。在给定的加热/冷却循环后，从新一代热响应性NanoVelcro CTC芯片中流出的洗 脱液中收集并计数CTC ;c)作为加热/冷却循环之函数的CTC纯度和存活力。尽管多个加 热/冷却循环有助于CTC释放性能，但是细胞存活力和纯度在某种程度上受到破坏。
[0019] 发明详述
[0020] 以下详细讨论了本发明的一些实施方案。在描述实施方案时，为清楚起见采用了 特定术语。但是，本发明并非旨在受所选特定术语限制。相关领域的技术人员应认识到，可 采用其他等价组件和开发其他方法而不背离本发明的广义概念。本说明书（包括【背景技术】 和发明详述部分）中任何地方引用的所有参考文献均通过引用并入文本，如同每篇参考文 献被单独并入一样。
[0021] "温度响应性材料（temperature-responsive material) "或"热响应性材料 (thermally responsive material) "或"热响应性材料（thermoresponsive material) "是 对温度变化表现出响应的任何材料，例如材料的一个或更多个特性随温度变化而变化。温 度响应性材料一般经历一个或更多个特性的大幅