单克隆抗体stro-4的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是2009年8月18日提交的题为"单克隆抗体STR0-4"的中国专利申请 200980141163. 9的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及热休克蛋白-90β (HSP_90f3)作为鉴定和/或分离多潜能细胞的标 记物的用途。更具体地，本发明涉及特异性结合人和绵羊HSP_9O0的单克隆抗体（称为 STR0-4)的鉴定。本发明还涉及通过本发明的方法富集的细胞群和这些细胞的治疗用途。
[0003] 发明背景
[0004] 包含造血支持性骨髓基质和相关骨组织的细胞组分源自一群多潜能细胞，该多潜 能细胞包括多潜能间充质干细胞（MSC)和它们的前体（间充质前体细胞（MPC))。MPC存在 于主要位于环绕血管的血管周围生态位的骨髓空间中（Gronthos S et al.，2003和Shi S et al.，2003)。在过去二十年中，研宄集中于不同人基质/间充质细胞群重建脂肪、骨、软 骨和肌肉的再生潜能（Gronthos S et al·，2003和Simmons PJ et al·，1991)。但是，这些 技术的成功应用取决于以下能力：分离纯化的MPC群，以及随后离体控制它们的生长和分 化。此外，需要克服通常与基于干细胞的疗法有关的各种技术和安全性顾虑，这通过在合适 的大量人疾病临床前动物模型代表中评价MPC制品（preparation)的安全性和功效实现。 人矫形和心脏疾病/创伤的绵羊模型已得到广泛使用，因为绵羊与人解剖、生理、免疫学和 胚胎发育具有相似性（Airey JA et al·，2004 ;Liechty KW et al·，2000 和 Mackenzie TC et al. , 2001) 〇
[0005] 同时，数种人多潜能细胞特异性标记物如STR0-1、⑶106、⑶146已经在文献中进 行了描述（Gronthos S et al·，2003和Shi S et al·，2003)，在人疾病绵羊模型中检查多 潜能细胞的治疗潜力的显著进展受到限制，这是因为缺乏允许分离和表征绵羊组织中等同 的多潜能细胞群的特异性试剂。诸如单克隆抗体的与绵羊和人多潜能细胞均反应的生物学 试剂的开发分别会极大促进在临床前和临床试验中监测和等同绵羊和人多潜能细胞群的 功能性的能力。
[0006] 已包括在本说明书中的关于文献、法规、材料、装置、论文等的任何讨论只是为了 提供本发明的背景。其不应被视作承认任何或全部这些内容由于存在于本申请每项权利要 求的优先权日之前而构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识。
[0007] 发明概沐
[0008] 本发明描述了一种称为STR0-4的新单克隆抗体（mAb)的产生和表征，该单克隆抗 体从未分级的绵羊和人骨髓鉴定和分离多潜能细胞。具体地，STR0-4抗体能够在两个物种 中基本上分离全部产克隆多潜能细胞（CFU-F :成纤维细胞集落形成单位）。分离的多潜能 细胞表现出高增殖潜能和多谱系分化。
[0009] 出人意料的，本发明人发现热休克蛋白-90 MHSP-90f3)蛋白在体内多潜能细胞 的细胞表面表达，并且据发现单克隆抗体STR0-4鉴定HSP-90 β上表达的独特表位。
[0010]因此，在一实施方案中，本发明提供了 HSP-90f3作为鉴定和/或富集多潜能细胞 的标记物的用途。
[0011] 在一实施方案中，本发明提供了一种富集多潜能细胞的方法，所述方法包括从组 织来源制备细胞样品并且富集表达所述HSP-90 β标记物的细胞。
[0012] 在本发明的一实施方案中，多潜能细胞是成体多潜能细胞。
[0013] 在一实施方案中，本发明的富集的细胞群没有被体外培养。
[0014] 在另一实施方案中，本发明的富集的细胞群能够产生产克隆CFU-F。
[0015] 在另一实施方案中，富集的细胞群对于HSP-90 β +/STR0-4+细胞是同质 (homogenous)的。
[0016] 在一个实例中，富集多潜能细胞的方法包括：
[0017] 使细胞样品与HSP-90 β结合剂接触；和
[0018] 将结合所述HSP-90 β结合剂的细胞与不结合所述HSP-90 β结合剂的细胞分离。
[0019] 在另一实施方案中，本发明还提供了一种鉴定细胞样品中多潜能细胞的存在的方 法，所述方法包括鉴定样品中表达所述HSP-90 β标记物的细胞。
[0020] 在一实例中，鉴定细胞样品中多潜能细胞存在的方法包括：
[0021] 从组织来源获得细胞样品；
[0022] 在适合于HSP_90f3与所述HSP_90f3结合剂结合的条件下，使所述细胞样品与 HSP_90f3结合剂接触；和
[0023] 检测结合所述样品中细胞的HSP_90f3结合剂的存在，其中结合所述HSP_90f3结 合剂的细胞指示多潜能细胞的存在。
[0024] 细胞样品可以源自疑似含有多潜能细胞的任何组织来源。例如，组织来源可以是 胎盘、脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、 卵巢、胰、骨、韧带、骨髓、腱或骨骼肌。在优选实施方案中，组织来源是骨髓。
[0025] 富集多潜能细胞的细胞来源可以是人或绵羊来源。但是，本发明还适用于源自其 他动物物种的细胞，包括牛、马、鼠、猪、犬或猫。
[0026] 本发明还涉及从本发明多潜能细胞的体外培养产生的子代细胞。本发明的扩增的 细胞可以具有多种表型，这取决于培养条件（包括培养基中刺激因子的数量和/或类型）、 传代次数等。
[0027] 在另一实施方案中，培养本发明的富集群产生还表达选自以下标记物的一种或多 种标记物的多潜能细胞：STRO-I、STRO-3 (TNSAP)、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、 P-选择蛋白、L-选择蛋白、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD 18、CD61、 整合蛋白0、6-19、血栓调节蛋白、〇)1〇、〇)13、5〇卩、？〇6卩-1?36卩-1?、16卩1-1?、如卩-1?、卩6卩-1?、 瘦蛋白-R、（STRO-2 =瘦蛋白-R)、RANKL、STRO-Itarigh^ CD146或这些标记物的任意组合。
[0028] 在本发明的另一实施方案中，本发明的多潜能细胞在培养时不能产生造血细胞。
[0029] 本发明的方法还可以包括在第一富集步骤之前收获多潜能细胞来源的步骤。这可 以包括，例如从受试者手术取出组织，并且从该组织分离细胞以形成单细胞悬液。这种分离 可以通过物理或酶促方式实现。这类方式是本发明领域的技术人员熟知的。在本发明的一 实例中，这个步骤涉及使用已知技术收集骨髓细胞。
[0030] 用于本发明方法的HSP-90f3结合剂可以是鉴定为具有对HSP-90f3的结合亲和力 的任何多肽或化合物。
[0031 ] 优选地，HSP-90 β结合剂特异性结合HSP-90 β。
[0032] 优选地，HSP-9O0结合剂特异性结合HSP-9O0上的表位，其中HSP-9O0包含与 SEQ ID ΝΟ:1(图5)的序列至少约75%相同的序列，优选与SEQ ID ΝΟ:1至少约78%相同， 更优选至少约80 %相同，仍然更优选至少约85 %相同，仍然更优选至少约90 %相同，甚至 更优选与 SEQ ID ΝΟ:1 至少约 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同。
[0033] 在一实施方案中，HSP-90I3结合剂选自肽、拟肽类（peptidomimetic)、核酸适配 体、肽适配体、树状聚体和小有机分子。
[0034] 在一实例中，HSP_90f3结合剂是寡核苷酸。优选地，寡核苷酸是标记的寡核苷酸。
[0035] 在另一实施方案中，HSP_90f3结合剂是纯化的抗HSP_90f3抗体或其抗原结合片 段或衍生物。抗HSP-9O0抗体可以是单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
[0036] 在本发明的一实施方案中，抗HSP_90f3单克隆抗体是由杂交瘤细胞系产生的 STR0-4抗体，所述杂交瘤细胞系依据布达佩斯条约（Budapest Treaty)的条款于2008年7 月10日保藏于ATCC，保藏登录号为PTA-9362。
[0037] 用于本发明方法的其他合适的抗HSP-90 β单克隆抗体包括可商购的抗 体，如小鼠抗人Hsp9O0mAb克隆H9010(Invitrogen)、小鼠抗Hsp90b mAb克隆 EMD-5E12 (Calbiochem)、小鼠抗人 HSP9O0 mAb 克隆 K3725B (Cosmo Bio Co. ,Ltd)和小鼠抗 人 Hsp9O0mAb 克隆 K3705 (Assay Designs/Stressgen Bioreagents)。上文未提及的其他 可商购的抗体考虑为在本发明范围内。
[0038] 在另一实施方案中，本发明提供了一种HSP_90f3结合剂或其抗原结合片段或衍 生物，其选自：
[0039] (i) STR0-4 单克隆抗体；
[0040] (i