通过过滤从生物样品提取或分离的罕见细胞的多种分析方法
【专利说明】通过过滤从生物样品提取或分离的罕见细胞的多种分析方 法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求在35U. S. C. § 119(e)下于2012年5月24日递交的U. S.临时申请号 61/651，437的优先权，该申请通过引用整体并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明涉及通过过滤从生物样品中分离罕见细胞，并且随后对这些罕见细胞和它 们的组分进行分析。罕见细胞具有使其与其它种类的细胞不同的特征，或者以使其与其它 种类的细胞不同的频率出现在生物样品中。罕见细胞的类型包括罕见的肿瘤或罕见的癌症 细胞，罕见种类的内皮细胞，罕见的胚胎细胞和罕见的被感染的白血细胞（白细胞）。
【背景技术】
[0004] 罕见细胞。罕见细胞以绝对低或相对低的数量，存在于从人类或动物获得的生物 样品。罕见细胞的存在经常与特定疾病、障碍或症状有关。例如，罕见肿瘤细胞可以在具有 肿瘤或癌症的受试者的血液中发现。
[0005] 罕见细胞的种类。存在很多不同种类的罕见细胞，并且罕见细胞非排它性地可以 是：
[0006] 上皮细胞和它们的祖细胞，间充质细胞和它们的祖细胞，成熟和不成熟的内皮细 胞和它们的祖细胞，成纤维细胞和它们的祖细胞，以及黑素细胞和它们的祖细胞；
[0007] 单核细胞和巨噬细胞和它们的祖细胞，活化的淋巴细胞和它们的祖细胞，浆细胞 和它们的祖细胞，嗜曙红粒细胞和它们的祖细胞，嗜碱性粒细胞和它们的祖细胞，及巨核细 胞和它们的祖细胞；
[0008] 任何亚型的干细胞；
[0009] 任何来源和类型的胚胎细胞，包括淋巴瘤细胞，红细胞，骨髓细胞，胚胎干细胞，诸 如细胞滋养层和合胞体滋养层的滋养层细胞，及胚细胞；以及
[0010] 任何来源和类型的肿瘤细胞，及任何分化程度的肿瘤细胞，包括肿瘤干细胞，肿瘤 微血栓，聚集的肿瘤细胞，任何类型的集合的肿瘤细胞（collective tumor cell),以及任 何来源和类型的非典型性细胞。
[0011] 一些种类的罕见细胞是病变细胞。这样的病变细胞的实例包括肿瘤或癌症细胞， 诸如源自或来源于肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳癌、胰脏癌、肾癌、肝癌、胃癌、食道癌，以及任 何类型的癌（careinoma)、肉瘤、骨髓瘤、黑素瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、白血病和淋巴瘤的 细胞。
[0012] 罕见细胞也与其中罕见细胞通过病变在生物样品中的数量增加或减少的病症相 关。这样的罕见细胞包括：
[0013] 病理上较高数量地存在于患癌症的患者或患心血管障碍（如心脏病发作）的患者 的血液中的内皮细胞；
[0014] 携带细胞内病毒、细菌或其它病原体，如HIV、HBV、HPV、志贺氏杆菌、利什曼虫、结 核病菌感染的单核细胞、感染的巨噬细胞、感染的淋巴细胞、活化的淋巴细胞；以及
[0015] 携带与遗传疾病相关的突变的细胞，如来自受遗传障碍影响的胚胎的胚胎细 胞，如非整倍性21、13、18、XXY、X0,地中海贫血，囊性纤维化，脊髓性肌萎缩，杜氏病 (Duchenne，s disease),亨廷顿氏病（Huntington's disease)等等，以及携带遗传突变或 与易患如下限定的病变相关联的分子特征的细胞：如病毒性感染、炎症、慢性退行性疾病、 阿尔茨海默、糖尿病、代谢紊乱。
[0016] 罕见细胞还可以与非病变症状，诸如怀孕相关联。
[0017] 罕见细胞可以典型地代表在生物流体中从约IO3至约10 1(1个细胞，从约10 4至约 101°个细胞，从约10 5至约10 1(1个细胞，从约10 6至10 1(1个细胞，从约10 7至约10 1(1个细胞， 或甚至从约IO8至约10 1(1个细胞的细胞群中的一个细胞。罕见细胞可以典型地代表在ImL 生物流体中小于500个细胞，ImL生物流体中小于200个细胞，ImL生物流体中小于100个 细胞，ImL生物流体中小于50个细胞，或甚至ImL生物流体中小于10个细胞。例如，已知循 环的肿瘤细胞（CTC)典型地为每一毫升血液中的约6xl0 6个白细胞，约2x10 8个血小板和约 4xl09个红细胞中存在1至10或1至500个CTC。
[0018] 分离罕见细胞的现有方法。
[0019] 可以从生物样品中提取或分离罕见细胞。提取的细胞是从液体样品中提取的细 胞，且没有与其它细胞分离。经分离的罕见细胞是与液体样品中存在的其它种类的细胞分 离的罕见细胞。从生物样品中提取或分离的罕见细胞对非罕见细胞的比例有差异，因此经 提取或分离的罕见细胞的纯度可以是可变的。
[0020] 已经提出了几种从生物样品中提取或分离罕见细胞的方法；尤其已经报道了几种 从血液中分离肿瘤或胚胎细胞的方法。但是，这些方法没有解决罕见细胞提取或分离的三 重挑战：（i)尽可能少的丢失或没有丢失，（ii)尽可能少的选择性偏差或没有选择性偏差 地进行罕见细胞的提取或分离；以及（iii)以使它们能够在多重分析程序中容易或同时使 用的方式，进行罕见细胞的提取或分离。
[0021] 仅重新获得样品中的一些罕见细胞的方法，在数量上损害了分离或提取的罕见细 胞在随后的分析程序中的应用。这些方法还可以引入选择性偏差。
[0022] 当提取或分离方法导致丢失样品中一种或几种类型的选择的罕见细胞时，则出现 选择性偏差。例如，通过使罕见肿瘤细胞与抗上皮细胞的抗体结合，从血液样品中分离肿瘤 细胞的方法造成不表达与抗体结合的上皮细胞抗原的罕见肿瘤细胞的丢失。
[0023] 苛刻的提取或分离程序，或以其它方式改变分离或提取的罕见细胞的可检测特征 的程序，折中解决了它们在随后分析程序中的应用。
[0024] 罕见细胞的诊断重要性。预期罕见细胞的检测和表征及它们在诊断和治疗中的应 用，将在人类和兽医临床实践中和研究中越来越重要。罕见细胞在个性化医学或诊疗，对患 者进行基于他或她的特定遗传特征和他或她的罕见细胞的特征的个体诊断疗法中的应用 是特别有价值的。在这种设置中，罕见细胞需要通过多种途径进行分析，该多种途径提供他 们的诊断鉴定和进行大规模表征。例如，通过旨在检测具有预后和/或治疗诊断价值的基 因突变的分子分析，可以对从患癌症的患者血液中分离的罕见细胞进行表征。但是，如果仅 进行靶向基因突变的分子分析，而没有旨在诊断血液中存在或不存在肿瘤细胞的分析，则 可能偏差地影响测试结果。事实上，如果从给定患者的血液中分离的罕见细胞不包括肿瘤 细胞，则在分离的罕见细胞中不存在基因突变将不表明循环肿瘤细胞中不存在基因突变。 因此，为了获得用于选择定向治疗的可靠的信息，以追踪它们的效果和检测可能的药物抗 性，需要对从生物样品中提取或分离的罕见细胞进行多种分析。
[0025] 进一步地，从血液或其它生物样品中提取或分离的罕见细胞可以用作通过外科手 术或半手术方法获得的样品的替代物，该外科手术或半手术方法包括非排它性的外科和半 外科介入、活检、腹腔穿刺术（Iaparocentesis)、胸腔穿刺、腹腔穿刺、脊椎穿刺、羊膜穿刺、 绒毛膜取样和脐穿刺。在这种设置中，罕见细胞代表珍贵的材料，需要通过用于诊断和/或 治疗诊断的应用和用于大规模分子和/或遗传表征的多种分析获取信息。
[0026] 肺癌来源的罕见细胞。肺癌是最普遍的赘生物，并且是全世界肿瘤相关死亡率的 主要原因[1-5]。尽管在切除的肺癌的治疗和转移肿瘤的更有效治疗中取得了最近的进 展，但患肺癌的患者的治愈率仍然很低。但是，最近发现了在肺癌中的致癌性驱动突变，以 及定向治疗的日益发展，示出在晚期患者中的新的令人鼓舞的结果[6-8]。在这些疗法中， 使用了吉非替尼（gefitinib)和埃罗替尼（erlotinib)，吉非替尼和埃罗替尼针对表皮生 长因子受体（EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂，显示出在10%至20%的腺癌中的酪氨酸活化突 变。最近，在小部分肺癌患者中，鉴定出涉及间变性淋巴瘤激酶（ALK) (2p23)和棘皮动物微 管相关蛋白样4 (EML4) (2p21)基因的基因组改变，该小部分肺癌患者对ALK小分子抑制剂 (克唑替尼（crizotinib))有显著有利的应答[7, 10-13]。根据在大多数肿瘤中大多数没 有KRAS和EGFR相关突变的系列，在1 %至7%的非小细胞肺癌（NSCLC)中，发现了 ALK基 因重排[10, 12-14]。具体的组织学特征表征了该小部分ALK阳性的肺腺癌，显示具有固体 或腺泡生长模式、多孔结构、存在粘液细胞（印指环状细胞（signet-ring cell)或杯状细 胞）、丰富的细胞外粘液、缺乏贴壁状生长（lepidic growth)及缺乏明显的核多形性[14]。 此外，在大部分系列中，患ALK重排的肿瘤的患者年纪较小，更常为男性，并且是从不吸烟 者/之前的轻度吸烟者[12, 14]。
[0027] 根据系列和方法，可以在超过40%的肺癌患者中分离循环的肿瘤细胞（CTC) [15-17]。此外，肺癌患者的预后（疾病晚期和早期）与CTC的存在和数量相关[15, 16]。 可以通过不同的直接和间接的方法分离CTC[18, 19]。已经证明，在NSCLC患者中分离的CTC 中存在基因组改变，尤其是在EGFR基因中出现的突变[20]。
[0028] 发明人之前已经证明了，甚至在正在经历肺癌手术的患者的早期疾病中，也能够 通过不同的方法分离CTC[15,21]。此外，CTC的存在和数量与较差的预后相关[15]。有趣 的是，通过使用根据它们的大小分离CTC的直接方法（ISET，通过上皮肿瘤细胞的大小进行 的分离），发明人定义了恶性细胞病理学标准，该恶性细胞病理学标准允许对具有恶性特征 的CTC进行良好的表征[22, 23]。而且，通过对从NSCLC患者中通过ISET分离的CTC应用 免疫细胞化学（ICC)途径，我们组和另一组示出了 CTC的可变数量显示出上皮-间叶细胞 转化（EMT)的表型[17, 21，24, 25]。
[0029] 还没有报道，对从肺癌患者分离的CTC中的ALK-基因重排进行测定。这是意义重 大的临床目标，用于非介入性预筛选肺癌患者，以避免与肺活检和肿瘤组织去除相关的潜 在的发病。
[0030] 滋养层的罕见细胞。已经报道了从母体血液中分离滋养层细胞的非介入性方法， 例如如在2010年1月26日颁布的U. S.专利7, 651，838中所述的方法。但是，需要通过完 全非介入性且安全（例如，没有引起流产的风险）的途径，从子宫颈样品中获得滋养层细胞 的方法。这样的方法应当始终如一地从怀孕女性中获取滋养层细胞，为了使该途径能用于 非介入性地在产前诊断遗传缺陷、疾病或障碍（Imudia AN, Kumar S, Diamond MP, DeCherney AH, Armant DR. Transcervical retrieval of fetal cells in the practice of modern medicine: a review of the current literature and future direction. Fertil SteriI. 2010:93:1725-30)。例如，通过提取游离的DNA，并且通过新一代测序分析游离的胚 胎DNA，可以实现在怀孕女性中诊断胚胎21三体综合征。如果游离的胚胎DNA的量太少， 则不能获得与存在或不存在胚胎非整倍性有关的可靠结果。因此，可以分析循环的胚胎细 胞，以进行非介入性产前诊断。U.S.专利7, 651，838描述了通过非介入性方法从血液中分 离滋养层细胞。可以从子宫颈样品中分离或提取滋养层细胞，但是不知道如何始终如一且 非介入性地（没有引起流产的风险）从子宫颈样品、子宫颈粘液或从自粘膜获得的样品中 获得滋养层细胞（Imudia AN, et al Fertil Steril. 2010:93:1725-30)。
[0031] 发明人试图通过如下方法解决上述问题：使用过滤和本文所公开的其它分离和分 析程序，从诸如血液和粘膜分泌物的生物样品中提取罕见细胞。
【发明内容】
[0032] 本文公开的方法解决了这些问题，并且使用过滤作为最适当的方式挑战了从生物 样品中提取或分离罕见细胞。在通过过滤进行提取或分离之后，罕见细胞存在于适于进行 多种或甚至同时的分析程序的症状中。该方法有效地从生物样品分离或提取罕见细胞，鉴 定罕见细胞，并且然后为了诊断目的而分子表征罕见细胞，以选择、引导、监控治疗，并且尤 其以选择定向治疗，并且监控对该定向治疗的应答和/或抗性。
[0033] 本发明包括分析或表征罕见细胞的各种模式。这些模式包括：（i)为了诊断或治 疗诊断的目的，使用定量分析和定性分析通过过滤分离的罕见细胞，并且随后选择疗法； (ii) "定性分析"包括对通过过滤分离的相同罕见细胞进行多种分析。对相同样品进行的 多种分析避免了与其中罕见细胞是不丰富的症状相关的问题，或与含少量罕见细胞的生物 样品相关的问题；（iii) "定性分析"包括通过过滤分离未固定（新鲜）的罕见细胞，允许进 行罕见细胞的培养和RNA分析；（iv)使用通过过滤分离的循环的肿瘤细胞，用于侵入性癌 症的早期诊断；以及（V)使用从子宫颈粘膜样品中分离的滋养层细胞，用于遗传障碍的非 介入性产前诊断。
[0034] 在它的一个方面中，本发明是用于对与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病进行鉴 定、诊断或提供预后的方法，所述方法包括：（a)通过使生物样品通过过滤器分离或提取罕 见细胞，并且在所述过滤器上获取分离的罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但 允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征；(b)确定所述分离或提取的罕 见细胞的细胞形态，和/或对所述分离的罕见细胞进行免疫标记，和/或对所述分离的罕见 细胞进行分子分析；（c)基于分离或提取的罕见细胞的细胞形态和/或免疫标记和/或分 子分析，鉴定与罕见细胞存在和/或数量和/或特征相关的症状、障碍或疾病和/或症状、 障碍或疾病的阶段。该方法可以用于分离、提取、浓缩或其它纯化在感兴趣的生物样品中的 罕见细胞。生物样品可以是含有或怀疑含有罕见细胞的任何生物样品。这样的生物样品包 括血液或其它细胞外流体、除了血液之外的生物流体，诸如羊水，眼房水和玻璃体液，胆汁， 血清，血浆，母乳，脑脊液，耵聍（耳屎），内淋巴，外淋巴，女性射精，胃液，粘液（包括从粘膜 收集的鼻腔引流、痰和其它材料），腹膜液，胸膜液，唾液，皮脂（皮肤油），精液，汗，眼泪，阴 道分泌物，呕吐物和尿液。这样的生物样品优选非介入性地获得，但是样品也可以从活检组 织或从由固体或半固体的组织样品制得的细胞悬浮液获得。
[0035] 生物样品可以从感兴趣的受试者获得，诸如已知患癌症或肿瘤，怀疑患癌症或肿 瘤，或有发展为癌症或肿瘤风险的受试者。样品也可以从如下受试者获得，该受试者已知患 有与罕见细胞相关或由罕见细胞引起的任何症状、障碍或疾病，怀疑患有与罕见细胞相关 或由罕见细胞引起的任何症状、障碍或疾病，或有发展与罕见细胞相关或由罕见细胞引起 的任何症状、障碍或疾病的风险，诸如非癌性增殖的症状、障碍或疾病。例如，生物样品可以 从如下受试者获得，该受试者：患有炎症和/或退行性症状、障碍或疾病，或怀疑患有或有 患炎症和/或退行性症状、障碍或疾病的风险；患有心血管症状、障碍或疾病，或怀疑患有 或有患有心血管症状、障碍或疾病的风险；或者含有感染症状、障碍或疾病，或怀疑患有或 有患感染症状、障碍或疾病的风险。
[0036] 在上面公开的方法中，在步骤（a)中，通过使生物样品穿过聚碳酸酯过滤器、 PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯）或其它适当的多孔的过滤器或材料