检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测丙型肝炎病毒抗体的试 剂盒及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV)引起的传染病，可通过血液、吸毒、母婴 及性传播等。有研宄表明，20 %~50 %的HCV感染者会发生自发性病毒清除，但是仍然有 50 %~80 %的感染者会持续感染，其中85 %进展为慢性肝炎，10~30年后，部分慢性丙肝 患者（尤其年龄较长患者）发展为肝硬化，2~10年后，可能发展为肝细胞癌。由于与慢 性乙肝相比，丙肝更隐蔽，潜伏期为2~26周；症状更不明显，高达75%的感染者无任何症 状，因此很容易被忽视，在中国，丙肝漏报率高达52%。
[0003]目前为止，尚未研制成功可以预防丙肝的疫苗，因此防治丙肝只有早诊断、早治 疗，防治病情的进一步恶化，否则将会使自身病情加重、影响身体健康，甚至可能将病毒传 染给其他人。因此有必要开发出一种性能较好的诊断方法，能有效地在早期就将该疾病诊 断出来，及时治疗，减少因丙肝带来的健康和财产的损失。
[0004] 目前HCV感染的诊断实验室化验方法有以下几种：1. HCV抗体检测。2.定量检测 11(^1?隱的分子试验（包括1^〇?，了麻40嫩）。3.11(^基因分型技术。而由于技术限制及 高昂的诊断费用，后面两种方法未能普及。
[0005] HCV抗体检测中常用方法有：酶联免疫吸附法（ELISA)、放射免疫法（RIA)、胶体金 法、化学发光法等。其中，ELISA检测丙肝抗体的方法已得到了大量的推广，该方法具有很 多优点，但在检测的灵敏度，稳定性等方面还有待进一步提高。全自动化学发光免疫分析 是在酶免疫分析基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，与其他 方法相比，这种方法有许多独特的优点，首先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积 小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了检测灵敏度；其次由于使用全自动仪器及配套 试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与 批间差异都较小。与放射免疫法（RIA)相比，化学发光免疫法除具有高灵敏度、高精确度、 高可靠性等优点外，还具有如下优点：a.无放射性污染，稳定性好；b.特异性高；c.试剂可 随用随取，测定方便迅速，可作为急诊检测项目。根据大量的实验结果以及临床应用资料， 从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，该方法逐渐成为取代放射性免疫分析和酶免 疫分析的首选。
[0006] 但是，目前尚无灵敏度和特异性较高的化学发光免疫诊断试剂，可以作为ELISA 试剂和其他试剂的替代品，用于丙肝的诊断。
【发明内容】
[0007]基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测丙型肝炎病毒抗 体的试剂盒，该试剂盒采用化学发光法，具有灵敏度高，特异性好和检测范围宽的优点。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0009] 一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，包括以下组分：
[0010] 1)磁性微球体系：包括有通过第一桥连物组合间接连接的磁性微球和HCV抗原；
[0011] 2)标记物体系：包括有通过第二桥连物组合间接连接的HCV融合抗原和标记示踪 物；
[0012] 所述HCV抗原和HCV融合抗原与HCV抗体在不同的位点结合。
[0013] 由于病毒性传染病的抗原往往较大，难以实现体外完整蛋白的表达，即使能够实 现完整蛋白的表达，由于种属差异，分子量比较大的蛋白往往不能正确折叠，后期的复性困 难，而制约检测试剂的开发。因此利用基因工程技术，将多个优势表面抗原肽基因融合表达 成为抗原研宄的方向。可利用HCV融合抗原制备灵敏度高、特异性好和检测范围宽的化学 发光免疫诊断试剂。
[0014] 在其中一个实施例中，所述第一桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白，或链霉 亲和素和生物素，或抗FITC (异硫氰酸荧光素）抗体和FITC (异硫氰酸荧光素）中的任意 一对；
[0015] 所述第二桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白，或链霉亲和素和生物素，或抗 FITC抗体和FITC中的任意一对；
[0016] 且第一桥连物组合和第二桥连物组合选用不同的桥连物组合，所述融合蛋白抗体 为针对标签蛋白的抗体。
[0017] 上述方案中，当第二桥连物组合选取融合蛋白抗体和标签蛋白对时，HCV融合抗原 中嵌有的标签蛋白与针对该标签蛋白的抗体有很高的特异性的结合，所以采用具有标签蛋 白的HCV融合抗原和融合蛋白抗体相配合的方式可以极大地提高试剂盒的检测灵敏度。而 亲和素（或链霉亲和素）是由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，可以同时与4个生物素相 结合，起到放大的效果，因此，当第二桥连物组合选取链霉亲和素和生物素时，能够提高试 剂检测灵敏度。
[0018] 在其中一个实施例中，所述第一桥连物组合为链霉亲和素和生物素，所述第二桥 连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白。即磁性微球体系包括有包被链霉亲和素的磁性微 球，和标记生物素的HCV抗原；标记物体系包括有标记示踪物标记的融合蛋白抗体，和具有 标签蛋白的HCV融合抗原。该优选方案采用了具有标签蛋白的HCV融合抗原和融合蛋白抗 体相配合的方式，以及利用链霉亲和素和生物素的搭桥作用将磁性微球和HCV抗原连接， 提高了检测灵敏度，使检测结果准确可靠。
[0019] 适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。 优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe 203或Fe 304磁性粒子和有机高分子材料进行 复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作 用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有 特别限制，可根据需要进行选择。
[0020] 本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0. 1-5 y m，磁性微球还可以通过表面改 性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
[0021] 在其中一个实施例中，所述磁性微球为Fe203或Fe 304磁性纳米粒子与有机高分子 材料的复合体，并具有〇. 1-5 y m的粒径，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有 一种或多种活性功能基团。
[0022] 在上述技术方案中，磁性微球体系中，磁性微球的工作浓度优选0. l_2mg/ml，链霉 亲和素的工作浓度优选1-20 y g/ml，生物素的工作浓度优选5-1000ng/ml，HCV抗原的工作 浓度优选25-5000ng/ml，FITC的工作浓度优选0. 5-50 y g/ml，抗FITC抗体的工作浓度优 选1-20 y g/ml ;标记物体系中，标记示踪物工作浓度优选5-500ng/ml，融合蛋白抗体的工 作浓度优选50-5000ng/ml，具有标签蛋白的HCV融合抗原的工作浓度可以为50-5000ng/ ml。可根据具体情况调整。将各试剂成分的浓度设定在此范围内，既能避免由于浓度过低 导致光信号低，影响试剂检测的灵敏度；又能避免浓度过高所造成的成本浪费。
[0023] 同样可以理解的，该试剂盒中的各组分均含有牛血清白蛋白（BSA)和防腐剂，BSA 的浓度为〇. 01-0. 5g/ml，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中 的任一种或两种以上混合物。
[0024] 上述标签蛋白（proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表 达的一种多狀或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、不踪和纯化等。
[0025] 在其中一个实施例中，所述标签蛋白选自：多聚精氨酸一标签蛋白（Arg-tag)、多 聚组氨酸-标签蛋白（His-tag)、Flag_标签蛋白、Strep-标签蛋白（Strep-tag)、c-myc_标 签蛋白、S-标签蛋白、葡萄球菌蛋白A-标签蛋白、麦芽糖结合蛋白-标签蛋白、硫氧化还原 蛋白-标签蛋白。通过上述标签蛋白的运用，便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化，并且 该标签蛋白还可以作为抗原，被标签蛋白的抗体识别，从而可以通过标签蛋白及其抗体的 搭桥作用将标记物和HCV融合抗原连接。
[0026] 在其中一个实施例中，所述标签蛋白为Flag-标签蛋白。Flag-标签蛋白为编码 8个氨基酸的亲水性多肽0YKDDDDK)，具有不会与其它蛋白相互作用且不影响其它蛋白功 能、性质等优点。并且还可以直接通过Flag-标签蛋白进行亲和层析，此层析为非变性纯 化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且具有纯化效率高的特点。
[0027] 在其中一个实施例中，所述HCV融合抗原是HCV Core(2_120aa)、 NS3(1192-1457aa)、NS4(1694-1735aa)，NS4(1859-1931aa)，NS5(2212-2313aa)基因片段串 联融合表达得到的。该HCV融合抗原的基因片段为上述基