Cars显微镜的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光学显微镜的高性能化。
【背景技术】
[0002] 光学显微镜不言而喻，是在自然科学、工学、工业领域中不能没有的观察工具。特 别是，近年来，作为照明光源而使用激光的更高性能的显微镜在尖端技术开发中变得必不 可少。其代表例是荧光共焦点显微镜，作为通过与荧光试剂的组合来观察生物体试样中的 特定物质的分布的手段而在医学、生物学领域中正在广泛地普及。进而，随着近年来的高 性能的短脉冲激光光源的出现，使用非线性光学效果的非线性光学显微镜的技术发展和医 学、生物学领域中的需求的提高很显著。作为非线性光学显微镜（或非线性显微镜）的例 子，已知有双光子焚光显微镜（非专利文献I)、SHG显微镜（非专利文献2)、相干反斯托克 斯拉曼散射（CARS)显微镜（非专利文献3)、受激拉曼散射（SRS)显微镜（非专利文献4) 等。例如双光子荧光显微镜能够选择试样的吸收较小的波长域作为向试样照射的激光，与 以往的荧光共焦点显微镜相比能够进行深部的成像。SHG显微镜是观察来自试样的第二高 次谐波的显微镜，能够有选择地检测骨胶原等光纤构造、细胞膜等特定的构造体。CARS显微 镜是向试样照射激励光和斯托克斯光这两种激光并对这些光的差频与试样分子的固有振 动共振的结果产生的反斯托克斯光进行观测的显微镜。通过反斯托克斯光的波长、强度分 布，能够观测试样中的特定物质的分布，作为代替荧光显微镜的无标签、非侵袭性的显微镜 受到关注。SRS显微镜与CARS显微镜同样是向试样照射激励光、斯托克斯光并将物质的固 有振动作为上述两种光的强度变化来观测的显微镜，与CARS显微镜同样是非侵袭性的显 微镜。像这样，非线性光学显微镜提供以往的显微镜不能实现的各种高性能的观察手段。
[0003] 这里，对CARS显微镜的动作原理进行说明。CARS是基于3阶极化的发光，为了产 生CARS，需要激励光、斯托克斯光、探测光。一般而言，为了减少光源的数量，用激励光代替 探测光。在此情况下，将被激励的3阶极化用
[0004] [数式 1]
[0005] Pas⑶（《 As) =IX r(3)(? As) +X nr(3)IEp2 〇p)E*s 〇 s)
[0006] 表示。这里，Xr(3) (?AS)是3阶电敏感度的分子振动的共振项，Xm(3)是非共振 项。此外，将激励光及探测光的电场用Ep表示，将斯托克斯光的电场用Es表示。非共振项 没有频率依赖性。数式1的ES的上角带有的星号表示复共轭。CARS光的强度如以下这样 表不。
[0007] [数式 2]
[0008] ICARS(Qas) °c |Pas(3) (?as) |2
[0009] 关于CARS光所产生的机构，使用分子的能级图（图14)进行说明。图14表示共 振项的过程。1401表示分子的振动基底状态，1402表示振动激励状态。将频率的激励 光和频率〇^的斯托克斯光同时照射。此时，分子经由中间状态1403被激励为1402的某个 振动激励能级。如果对处于该激励状态的分子照射频率^^的探测光，则一边经由中间状态 1404而产生频率《AS的CARS光，一边分子回到振动基底状态。将此时的CARS光的频率表 示为oAS= 2? P-tos〇
[0010] 从图14可知，该共振CARS光仅在激励光与斯托克斯光的频率之差《p-《S和 观测试样的某个振动激励状态一致的情况下产生（其中，这里采用普朗克单位制，普朗克 常数为1)。因而，在作为斯托克斯光而使用了宽频带的光源的情况下，所产生的CARS光也 为宽频带的光，但具有在与振动激励状态对应的波长下有尖锐的尖峰的光谱。该光谱被称 作拉曼光谱，反映试样中的分子的振动激励状态的分布，可以用于分子种类的确定。
[0011] 在图15中表示与数式1的非共振项有关的一个过程。斯托克斯光的频率不是振 动激励状态，而是经由了中间状态1405的过程。通过频率Up的激励光和频率p的探 测光的同时照射，激励出电子等参与的1405的中间状态，进而，通过频率s的斯托克斯 光，经由中间状态1406而产生频率《AS的非共振的CARS光。由于该非共振的CARS光与振 动激励状态无关地产生，所以在使用了宽频带的斯托克斯光的情况下，产生不具有强度的 波长依赖性的宽频带的非共振CARS光。这些共振CARS光和非共振CARS光相互相干且干 涉。实际在试样的分子种类的确定中需要的是共振CARS光的光谱即拉曼光谱，所以需要从 所取得的CARS光的光谱取得拉曼光谱的信号处理。关于该信号处理已知有一些方法（参 照非专利文献5)，例如通过从强度光谱恢复相位光谱的方法即最大熵法进行数学计算，求 出共振项的复数部分。
[0012] 另外，激励光、斯托克斯光、CARS光的频率的关系如图16所示。具有规定的频率的 激励光和处于比其小的频域中的斯托克斯光向试样入射，在比激励光大的频域中产生CARS 光。
[0013] CARS显微镜对于如上述那样求出的拉曼光谱，改变将激励光、斯托克斯光聚光的 位置而进行多次测定，结果取得每个分子种类的空间分布的图像。
[0014] 现有技术文献
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献I:W. Denk et al.，"Two - Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy，"Science，Volume 248, Issue 4951，pp. 73 - 76(1990)
[0017] 非专利文献 2 :P. J. Campagnola et al.，"Second - harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells， tissues and organisms,Nature Biotechnology 21,1356 - 1360(2003)
[0018] 非专利文献 3 :M. Okuno et al.，"Quantitative CARS Molecular finger printing of living Cells，"Angewandte Chemie International Edition 49,6773 - 6777(2010)
[0019] 非专利文献 4 :B. G. Saar et al.，"Video - Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering，''Science Vol. 3301368 (2010)
[0020] 非专利文献 5 :J. P. R. Day，K. F. Domke，G. Rago，H. Kano，H. Hamaguchi， E. M. Vartiainen，and M. Bonn"Quantitative Coherent Anti - Stokes Scattering(CARS) Microscopy，"J. Phys. Chem. B，Vol. 115, 7713 - 7725(2011) 发明概要
[0021] 发明要解决的问题
[0022] 以上所述的荧光共焦点显微镜、非线性光学显微镜的共同点是将试样的物质种类 及特定构造的分布可视化。相反，不能得到试样的光学特性，即折射率、透射率等基本信息。 当观察细胞等生物体试样时，不仅需要通过非线性光学显微镜或荧光共焦点显微镜得到的 物质分布的信息，而且在更详细的试样的解析中有时需要折射率及透射率的信息。因此，以 往在这些显微镜观察时，辅助性地并用以往以来使用的明视野显微镜及相位差显微镜等。 但是，这些显微镜观察不会给出定量的折射率、透射率分布，最多是掌握试样的形状的程度 的辅助性的观察。
【发明内容】
[0023]
[0024] 鉴于上述问题，本发明的目的是提供一种给出试样的物质种类或特定构造的分 布、和折射率或透射率等光学特性的定量分布的显微镜。
[0025] 用于解决问题的手段
[0026] 为了达到本发明的目的，采用了以下技术方案。
[0027] (1)具备：短脉冲激光器等光源；分束器等第一光分割机构，将来自光源的输出光 光通量分割为第一激励光通量和第二激励光通量；光子晶体光纤等斯托克斯光源，被输入 上述第二激励光通量，输出斯托克斯光通量；分色镜等合波机构，将上述第一激励光通量与 上述斯托克斯光通量进行合波，生成合波光通量；物镜透镜等第一聚