蛋内禽胚胎性别、活力和/或发育阶段确定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及确定蛋内禽胚胎性别、发育阶段和/或活力的方法，通过测定蛋内，更 具体地说是尿囊液中发育标志物的存在。本发明方法进一步涉及确定禽胚胎活力、和选择 雄蛋和雌蛋、以及应用这些选择的蛋生产疫苗和/或雏禽（Chick)的方法。
【背景技术】
[0002] 大多数禽类的受精卵，尤其是那些商业饲养的禽类的受精卵，如家鸡（Gallus gallusdomesticus)、鸭、鹅及火鸡倾向于最终孵化出大致均等分布的雄性和雄性雏禽。在 孵化场管理中，可能期望在各种特性尤其是性别的基础上分离禽类。举例来说，可能期望给 雄性和雌性禽类接种不同的疫苗，或者在雄禽和雌禽的生长速率以及营养需求存在差异的 情况下分离群体以获得饲养效率、提高处理均一性并降低生产成本。而且更进一步，对于商 业化的蛋生产，雄性雏禽的孵育和饲养是极不可取的，导致每年扑杀数十亿雄性雏禽。
[0003] 此外，有部分蛋没有受精，或在孵育阶段开始便不含活的胚胎，这大大降低孵化场 的孵化箱的能力。到目前为止，活的胚胎的确定通常采用一种称为"透光检验"的技术进行， 如EP-A-2369336 和US7950349 中所公开。
[0004] 其中，用光源检查蛋，所述光源发射能够至少部分通过蛋的波长的光。
[0005] 尽管这可以鉴定蛋是否含有活的胚胎，然而，为了得到可靠的结果，需要所述蛋发 育到至少第11天，或甚至是其发育更后期。并且，虽然这种技术可以区分活的和无活力的 蛋，它不能可靠地确定未孵化鸟类的性别和其他特征。
[0006] 因此，目前所需要的雏禽农场的孵化能力是有早期性别选择，能够仅主要选择雌 性雏禽胚胎所需的至少两倍大。
[0007] 相应地，通过减少所需能源和其他资源的量，将对环境将有很大价值，但同样对消 除不必要的雄性雏禽扑杀，以及减少新孵化禽类的压力也有很大价值，如果有早期方法允 许在孵育期之前确定禽胚胎的性别，也能大大增加孵化场的能力。
[0008] 如果该方法还能够在未受精和/或其他无活力的蛋中选择活的胚胎的话，另一益 处是将进一步提高孵化过程的效率。
[0009] Y.Feng等人在Appl.Magn.Reson. (2007)，32, 257-268 公开了通过 900MHz超高场 强NMR波谱分析第9天鸡蛋尿囊液中的代谢物。
[0010] GuD.-C.等人，ChineseJournalofAnimalScience,Vol. 7, 23-25 公开了通过 HPLC分析蛋养殖孵育期间尿囊液及羊水中游离天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和亮氨酸浓度。但 是，该公开方法未超出产生一个基准线，用于比较非特定产蛋日期的蛋，仅简单建立四种氨 基酸的基准线。此外，该公开的检查方法是破坏性的，因为有活胚胎的蛋在检查后不能成熟 至孵化，或用于其他用途，例如疫苗生产。
[0011] US-A-2003/0096319和W0-A-2006124456公开了通过测定胚胎流体样品如来自禽 类蛋的尿囊液或血液中雌激素类固醇化合物的存在确定蛋内禽胚性别的方法。虽然不用破 坏蛋是可行的，但雌激素类固醇的量很少，而且只有生殖腺发育后测试才会成功，即在胚胎 发育的一个相对较晚的点。更进一步，W0-A-2006124456的方法似乎也需要对每个种类及 其亚类的荧光标记进行修饰，或对这些种类进行遗传修饰。
[0012] OhtaY.等人，PoultryScience,Vol. 80,Nr. 10, 1430-1346 公开了蛋内施加氨基 酸的效应，以观察这如何影响胚胎的氨基酸浓度和来自肉鸡种蛋的其他蛋内容物。然而，这 不是一种确定性别、活力和/或禽蛋的发育阶段的方法。
[0013] 发明概沐
[0014] 因此，本发明涉及确定蛋内禽胚胎的性别、发育阶段和/或活力的方法，包括（a) 在从开始孵育蛋直至孵化的时间段内检测蛋内选自糖和/或氨基酸、其前体和代谢物的至 少第一发育标志物化合物；(b)测量至少第一被检测的发育标志物化合物的量，和（C)将所 述量与确立的雌性和雄性、胚胎的发育阶段、和/或活的和死的或未发育胚胎的基准线比 较，以确定胚胎是否是活的、雄性和/或雌性、和/或胚胎的发育阶段。
[0015] 另一方面，本发明的方法还涉及确定蛋内禽胚胎的性别和/或活力的方法，包括 (a)在从开始孵育蛋到孵化的时间段内检测蛋内选自糖和/或氨基酸、其前体和代谢物的 至少第一发育标志物化合物；(b)测量至少第一被检测的发育标志物化合物的量，和（C)将 所述量与确立的雌性和雄性、和/或活的和死的或未发育的胚胎的基准线比较，以确定胚 胎是否是活的、雄性和/或雌性。
[0016] 更进一方面，本发明涉及根据以上任一项确定蛋内禽胚胎发育阶段的方法，包括 (a)检测蛋内选自糖和/或氨基酸、其前体和代谢物的至少第一发育标志物化合物；(b)测 量至少第一被检测的发育标志物化合物的量，和（c)将所述量与确立的从产蛋直至孵化的 发育阶段的基准线比较，以确定胚胎的发育阶段和直至可能发生孵化的时间。
【附图说明】
[0017] 图1描述了基于1H NMR中检测到的实验组鸡蛋的所有代谢物，对分组样品的1H NMR数据的偏最小二乘法建模，一种无监督多变量数据分析。F代表雌性，M代表雄性。
[0018] 图2描述了基于1H NMR中检测到的商业化鸡孵化场的较大测试组的所有代谢物， 对分组样品的1HNMR数据的偏最小二乘法建模，一种无监督的多变量数据分析。F代表雌 性，M代表雄性。
[0019] 发明详沐
[0020] 现在参考附图在下文更充分地描述本发明，其中示出本发明的优选实施方案。然 而，本发明可以以不同形式实施，不应理解为局限于这里列出的实施例；更确切地说，提供 这些实施方案使得该公开详尽和完整，并向本领域技术人员充分传达本发明的范围。除非 另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员一般 所理解的相同的含义。本发明说明书中使用的术语仅是为了说明特定实施方案，而非意在 限制本发明。
[0021] 本文使用的术语"禽（avian) "和"鸟（bird) "包括任何雄性或雌性禽类，但主要 意在包含为获取蛋或肉类的商业化饲养家禽。因此，术语"鸟"和"禽"特别意在涵盖鸡、火 鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡。
[0022] 本文中术语"孵育"指鸟孵化它们的蛋的过程，以及离开了雌禽生殖道后蛋内胚 胎的发育。本文的孵育阶段指不间断的时间，其间特定的蛋被置于模拟孵蛋的条件中直到 孵化，即鸟出现，包括任何操作或从例如孵化器至孵化单元的转移，假如鸟的发育不停滞的 话。
[0023] 本文使用的"蛋内"指孵化前包含在蛋内的鸟胚胎。本发明可用任意类型鸟蛋实 施，包括但不限于（家）鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡蛋。
[0024] 本文中术语"注射（injection) "和"注射（injecting) "包含向蛋或胚胎内插入 装置（通常是延长装置）的方法，包括向蛋或胚胎内递送或释放物质的方法，从蛋或胚胎去 除物质（即样品）的方法，和/或向蛋或胚胎内插入探测器装置的方法。
[0025] 优选地，本发明的确定以非破坏性的方法进行，即允许如此测试的禽胚胎生长，如 果需要的话，或让它接受其他步骤，例如蛋内疫苗生产，假如胚胎是活的话。
[0026] 本文中术语"尿囊液"包含有或没有其他蛋材料存在的尿囊液。例如，术语尿囊液 可包括血液和尿囊液的混合物。本发明的实施方案并不局限于从尿囊液或从蛋的上表面附 近区域提取材料。本文所述的从尿囊液去除材料，仅作为本发明可能实施方案的一个例子 提供。如下所述，各种材料，包括但不限于羊膜、蛋黄、壳、蛋清、组织、膜和/或血液，可从蛋 中提取并测定，以鉴定一个或多个发育标志物。材料可取自具有几乎任何定向的蛋。
[0027] 本文中术语"预先确定的位置"指蛋内固定的位置或深度。例如，装置可被注射入 蛋内至蛋内固定的深度和/或固定位置。在替代实施方案中，注射可基于从蛋获得的信息 进行，例如关于蛋内胚胎或胚下腔的位置。
[0028] 有利地，"比较所述量"一词可包括被测量代谢物的单变量或优选多变量分析，和 确定禽胚胎与某一群体的相关性。该步骤可包括通过质谱、NMR或其他测得的合适数据的 多变量统计分析，确定样品中分析物即代谢物的存在。多变量统计分析程序优选包括主成 分分析的程序，和/或偏最小二乘回归分析程序。因此本发明还涉及确定蛋内禽胚胎性别、 发育阶段和/或活力的方法、装置和系统，其包括多变量统计分析程序，以及植入了其确定 方法的微处理器。
[0029] 本发明实施方案的方法和装置可用于在胚胎发育阶段又称为孵育期间的任意时 间鉴定蛋的一或多个特征。本发明的实施方案并不限于胚胎发育阶段的特定一天。
[0030] 在本发明方法中，可优选侵入性或非侵入性分析发育标志物。
[0031] 如果分析是侵入性进行的，这通常包括提取蛋材料样品。该样品优选从胚胎流体 提取，优选取自尿囊液，因为这将最少损害胚胎。尿囊液通常是禽胚胎含氮代谢物的排泄媒 介。尿囊液从大约孵育第3天开始形成，如HamburgerV和HamiltonHL(1951)."Aseries ofnormalstagesinthedevelopmentofthechickembryo".Journal