肌钙蛋白i检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种能够快速准确的对肌钙蛋白I进行定量分析的肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]全球每年有约1700万人死于心血管疾病，其中一半以上死于急性心肌梗死(AMI)。每年约有1000万例心肌梗死患者，其中约300万例是ST段抬高的急性心肌梗死。心肌细胞损伤后，膜的完整性和通透性改变，细胞内的大分子物质逸出，能够在血液循环中被检测到，这些大分子物质被称为心肌损伤标志物，简称心肌标志物。心肌标志物的检测可直接影响心血管疾病患者的临床诊断、危险分层、治疗方案选择和预后判断，对于临床诊断和治疗心血管疾病具有重要意义。
[0003]在诸多诊断AMI的临床生化指标中，肌酸激酶同功酶(CK-MB)曾一度被认为是诊断AMI的“金标准”，已广泛应用多年。随着对心肌肌钙蛋白的深入研究，无论是对心肌的特异性还是诊断敏感性，CK-MB的地位都受到了严重挑战。心肌肌钙蛋白被认为是目前最好的心肌标志物，正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。
[0004]肌钙蛋白是组成横纹肌细肌丝的结构蛋白，由T、C、I三亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。其中，肌钙蛋白I (cTnl)经大量的研究，已被证实为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一。cTnl分子量22.5KD，正常人血清中含量低于0.06ng/ml,当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物分解，cTnl被快速释放到血液中，4-6小时后开始在血液中升高，12-24小时后达到最高浓度，最高浓度能达到正常值的上万倍，升高的cTnl能在血液中维持6-10天。因此，与CK-MB相比，cTnl对心肌损伤的诊断敏感性更高，特异性更强，持续时间更长，所以cTnl已成为目前最理想的心肌标志物。
[0005]cTnl检测方法主要有双抗夹心法(ELISA)、免疫发光法、放射免疫分析法，胶乳颗粒增强免疫比浊法、金标方法等。ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；放射免疫分析法灵敏度可达到4pg/ml，能检测正常人血清cTnl，比双抗夹心法灵敏，缺点是所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比ELISA差，且存在放射性污染危险；胶乳颗粒增强免疫比浊法(PETIA)可以很方便的应用与全自动生化仪，但是灵敏度较低，无法检测到心肌细胞的早期损伤；金标方法灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测；免疫发光法方法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。因此开发灵敏度更高、快捷方便的cTnl产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法。
[0007]本发明可以通过以下措施达到:
一种肌钙蛋白I检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有:PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540_600nm的荧光；所述单克隆抗体为2+2模式，即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成，以同时保证特异性和亲和力。
[0008]本发明所述结合垫的稀土突光微球的直径优选是90_110nm ;所述稀土突光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土突光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土突光微球标记的抗体优选2种高质量的单克隆抗体。
[0009]本发明所述结合垫采用如下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中(含3.0% Triton X-100,2.0%BSA, ρΗ7.5)，4°C浸泡4小时，然后取出37°C烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在B1-DotXYZ3050三维喷点平台上，用B1-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37°C烘干2小时后制得。
[0010]本发明中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体采用如下步骤制得:
步骤1:单克隆抗体的获得:根据2+2模式，购买并筛选高质量的单克隆抗体，进行配对实验，筛选出捕获抗体和检测抗体各两种，将用于检测的2种抗体，按照后续工作需要分装后保存于_20°C备用；
步骤2:稀土荧光微球的醛基化:取1.5mg稀土荧光微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗漆3遍,离心速度为12000rpm,时间为5分钟,最后重悬于100 μ I的上述碳酸盐缓冲液中，加入150 μ I醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μ I的上述碳酸盐缓冲液中，置于4°C备用；
步骤3:稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的制备:将1.5mg用于检测的肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)用上述碳酸盐缓冲液于4°C透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4°C反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4°C反应4小时；再加入等体积的封闭液(150mM Tris-HCL, pH7.5，含3%BSA，5%蔗糖)，4°C封闭过夜；然后用150mM Tris-HCL, pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100 μ I的150mM Tris-HCL 缓冲液中(含 1.2%NaCL，2%BSA，l%Tween 20)，4°C避光保存备用。
[0011]本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得:
步骤1:根据前述筛选和配对实验，选择用于捕获的2种抗体，按照后续工作需要分装后保存于_20°C备用；
步骤2:分别用包被稀释液将肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到l_5mg/ml，膜液量为1_2 μ 1/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7_，然后置于烘箱中，37°C烘干2小时。
[0012]本发明所述样品垫通过以下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于含有1.5%TritonX-100, 2% BSA, 0.15M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4°C浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37°C烘干2小时。
[0013]本发明还提供了一种如上所述试剂盒实现的肌钙蛋白I检测方法，其特征在于包括以下步骤:
步骤1:将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；
步骤2:精确吸取25 μ I血清样本，样本为全血时吸取50 μ I样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100 μ I样本稀释液，样本稀释液采用生理盐水或PBS，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；
步骤3:设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对肌钙蛋白I的检测范围为0-40ng/ml。
[0014]本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于肌钙蛋白I定性胶体金试剂，能定量检测样本中的肌钙蛋白I含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
[0015]【附图说明】:
附图1是本发明中试纸卡的结构示意图。
[0016]附图2是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。
[0017]附图3中的附表I是本发明中实施例3的精密度分析结果数据。
[0018]附图标记:PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。
[0019]【具体实施方式】:
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明:
如附图1所示，本发明首先提出了一种肌钙蛋白I检测试剂盒，盒内设有试纸卡，所述试纸卡由下至上依次设有=PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中结合垫3上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm,稀土突光微球掺杂稀土镧系元素,在基态下稳定,在340_380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为2+2模式，即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成，以同时保证特异性和亲和力；
所述结合垫3的稀土荧光微球的直径优选是90-1 1nm ;所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土突光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土突光微球标记的抗体优选2种高质量的单克隆抗体。
[0020]实施例1:
肌钙蛋白I检测试剂盒中试纸卡的各组成部分可以通过以下措施制得:
1、样品垫2的制备:
将玻璃纤维膜浸泡于含有1.5%Triton X-100, 2% BSA, 0.15M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4°C浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37°C烘干2小时。
[0021]2、吸附荧光微球标记抗体的结合垫3的制备:
将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中(含3.0% Triton X-100,2.0%BSA,pH7.5)，4°C浸泡4小时，然后取出37 °C烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在B1-DotXYZ3050三维喷点平台上，用B1-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37°C烘干2小时后制得；
稀土荧光纳米微球的醛基化:取1.5mg稀土荧光微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗漆3遍,离心速度为12000rpm,时间为5分钟,最后重悬于100 μ I的上述碳酸盐缓冲液中，加入150 μ I醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μ I的上述碳酸盐缓冲液