双功能复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于双功能免疫复合纳米球快速检测食源性致病菌的方法，更确 切地说本发明涉及双功能复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法，属于微生物检测领 域，可W用于医学诊断、食品安全、环境监测等方面。
【背景技术】
[0002] 细菌性病原体严重危害人类的健康。食源性致病微生物种类繁多，缺乏灵敏、便 捷、特异的快速检测技术，是食品安全无法得到有效保障的主要原因之一。因此开发针对致 病菌的快速、灵敏、可靠的检测方法和现场、便携的检测仪器，是食品安全和国家安全保障 的迫切需要。
[0003] 用传统的微生物选择培养方式来检测致病菌的存在，结果虽然可靠，被视为微生 物检测的金标准。但是，传统的微生物培养法耗时长、步骤繁琐、需要多种培养基和试剂，无 法满足当今社会一些突发事件对微生物现场快速检测的迫切需求。因此基于分子生物学的 各种检测方法应运而生。该些方法概括起来主要有H类；（1)基于链式聚合反应（PCR)的检 巧IJ。PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测；（2)基于免疫反应的检测。该类方法经 济实用，重现性好，快速，目前大多数食品微生物快速检测的商业化产品的反应原理是基于 H明治免疫分析，即免疫复合物包含固定抗体、祀细菌和二抗标记物。（3)生物传感器。它 是与生物、生物衍生物相关的分析器件、联合或者集成的物理化学传感器或者转换微系统。 与传统的检测方法相比，生物传感器具有体积小、成本低、灵敏度高、选择性及抗干扰能力 强和响应快等优点，在食品安全检测中具有广泛的应用价值，是食品安全检测的一个重要 发展趋势。
[0004] 多功能纳米材料在医学诊断、食品安全、环境监测等领域具有巨大的潜能。多功能 纳米粒子拥有磁、热、表面等离子体共振和英光性质已报道。合理设计多功能纳米结构是生 物传感器检测和诊断的关键，如晶体结构和粒径的控制，表面性质的设计，结合特异性的生 物分子(抗体、DNA、酶等)。该些是关键参数决定检测灵敏度、准确性和特异性。
[0005] 复合纳米结构包含两种或两种W上的功能纳米材料，代表一类重要的多功能纳米 系统。量子点又称半导体纳米微晶体，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的能够接受 激发光产生英光的半导体纳米颗粒，其颗粒直径一般约为1-lOOnm。由于其具有独特的量子 尺寸效应和表面效应，表现出优良的光谱特征和光化学稳定性。利用量子点进行英光标记， 相比传统的有机染料分子具有许多优点，如广泛的吸收光谱、狭窄的发射光谱、高英光量子 产率、抗光漂白性等。磁性颗粒具有粒径小，比表面积大，表面有许多息空键，可W通过共 聚、表面改性赋予其表面多种反应性功能基巧日駿基、氨基、琉基、生物素、单克隆抗体等）等 优点；同时生物相容性良好，有利于生物分子巧日：酶、核酸、抗体等）的固定；易于在磁场作 用下迅速聚集，所W广泛应用于生物分析领域。将该两种纳米材料组合成复合纳米结构不 仅可W阻止超顺磁纳米颗粒聚集，还能够减轻量子点的生物毒性，同时兼具量子点和磁性 纳米颗粒的优良性能。娃纳米粒内部不仅可包埋大量的且可调控英光物质和磁性氧化铁， 具有较强的英光强度和超顺磁性；由于娃壳的保护，使得英光染料不易外泄而具有光稳定 性，借助MRI、激光共聚焦扫描显微镜及透射电镜可实现对细胞进行原位标记、追踪和造影， 加之娃壳表面富含羟基，易被其他的生物分子、祀向剂等官能团进行表面修饰，从而改善纳 米粒的物理化学性能，且可作为携带药物和基因载体。
[0006] 近年来，很多研究者基于免疫学原理在开发致病菌检测新方法和新器件方面 做了很多有益的探索。2005年Hahn等用链酶亲和素修饰的量子点英光抗体探针检测 0157 : H7,其检测灵敏度比使用普通有机英光染料探针要高出两个数量级，且英光发光 时间达到数小时，远优于普通染料的数砂发光；同时由于链亲和素-生物素体系的放大作 用，进一步提高了检测灵敏度，实现了单细胞的检测。Tan课题组使用抗体连接的娃基英光 纳米材料发展了一种快速、超灵敏的原位免疫分析方法，该种方法不需要扩增和富集就能 达到检测单种菌。2009年Pividori课题组利用由石墨-环氧复合物构建了一种磁传感 器，可W通过免疫的方法在富集捕获致病菌的同时，通过电化学检测或者双标记PCR检测 Salmonella,具有灵敏，快速的优点。基于抗原抗体结合原理，尽管在致病菌检测方面已经 出现了很多新方法，但是在如何提高检测灵敏度和缩短检测时间方面，仍然是亟待解决的 问题。因此引入功能性的新型纳米材料有望可W为致病菌灵敏快速检测带来新的契机。该 也成为本发明的构思。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种双功能免疫复合纳米球及快速检测食源性致病菌的 方法。本方法所述的双功能复合纳米球采用二氧化娃同时包埋磁性氧化铁纳米颗粒和量子 点，构建了同时具有光学性质和超顺磁的双功能纳米球。然后将双功能复合纳米球分别将 量子点和纳米球与可W特异性识别食源性致病菌的单克隆抗体连接，得到能够与菌表面抗 原进行抗原-抗体反应的免疫量子点探针和免疫复合纳米球探针。该种复合结构的纳米球 既可W作为免疫识别分离致病菌的载体，又可W作为前面"标签"的信号增强子，实现检测 信号的二次放大，通过光学检测可W知道待测样本中是否存在目标微生物。该样通过磁性 纳米颗粒免疫分离和量子点"双重标签"的信号扩增效应，能够大大缩短检测时间，提高灵 敏度。适合于食品、环境样品的现场快速检测及基层普及应用。
[000引技术方案
[0009] 本发明涉及一种双功能免疫复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法。具体是 所述的双功能免疫化he纳米球是娃基复合纳米球，由二氧化娃同时包埋磁性纳米颗粒和 量子点形成，然后分别将纳米球和相应量子点与可W特异性识别目标食源性致病菌的单克 隆抗体连接，得到能够与菌表面抗原进行抗原-抗体反应的免疫纳米球探针和免疫量子点 探针；然后用W上两种探针通过免疫的方法捕获、标记和分离菌息液或者样品中的致病菌； 最后通过光学检测特征吸收峰的强度，从而实现待测菌的检测。通过该种双功能纳米球一 方面可W实现待测菌的免疫磁分离，另一方面实现光学信号的二次放大，显著提高致病菌 检测的灵敏度（1妒C化/mL)和缩短检测时间（《2小时)。
[0010] 所述的双功能复合纳米球的制备方法，其包括W下步骤：
[0011] (1)水、己醇、氨水按照一定比例混合，上限体积比例为33 ;16山下限体积比例为 20 ：16 ：15 ；
[0012] (2)加入磁性纳米颗粒和量子点；
[0013] (3)加入正娃酸己脂和己醇的混合液化限体积比例为4 ;21 ;下限体积比例为1 : 24)，揽拌反应，生成纳米球；
[0014] (4 )磁分离和己醇清洗，真空干燥。
[0015] 利用双功能复合纳米球快速检测食源性致病菌的方法，包括W下步骤：
[0016] (1)制备双功能复合纳米球，同时具有磁性和光学性能；
[0017] (2)构建免疫双功能纳米球探针，即特异性识别目标食源性致病菌的单克隆抗体 与复合功能纳米球连接；
[0018] (3)构建免疫量子点探针，即特异性识别目标食源性致病菌的单克隆抗体与量子 点连接；
[0019] (4)采用H明治夹也免疫分析法对目标食源性致病菌进行检测。具体步骤包括：
[0020] 步骤a);样品的预处理
[0021] 按照不同样品的性质进行相应的预处理，制备成合适的样品溶液。
[002引步骤b);目标致病菌的富集
[0023] 将免疫双功能纳米球探针加入到样品溶液中，共赔育，充分反应后，磁分离除去上 清液，缓冲液洗涂两次，W达到去除杂菌的目的，从而得到包含目标致病菌和纳米球探针的 缓冲溶液。
[0024] 步骤C);免疫量子点探针标记
[0025] 在步骤b)所述样品中加入一定量的免疫量子点探针，共赔育，充分反应后，磁分离 除去上清液，缓冲液洗涂两次，可W去除多余的量子点探针，得到形成类似H明治结构(量 子点探针-目标致病菌-纳米球探针）的缓冲溶液。
[002引步骤d);英光测定
[0027] 将步骤C)所述溶液置英光光谱仪中测定其特征吸收峰的强度，从而判定目标微生 物的数量。
【附图说明】
[0028] 图1包埋超顺磁性纳米颗粒和量子点的双功能纳米球的示意图；
[0029] 图2基于双功能纳米球快速检测致病菌的流程示意图。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体实施例的介绍，进一步阐述本发明的实质性特点和显著的进步，但 本发明决非仅局限于实施例。
[0031] 实施例1:双功能纳米球的制备
[0032] 本发明中双功能纳米球通过改进的StSber法制备获得。具体是在一定浓度的氨 水催化下，正娃酸己醋在己醇溶液中水解得到的。通过调节氨水、正娃酸己醋、己醇、水、磁 性纳米颗粒和量子点的相对浓度，可W改变双功能纳米球的性质和尺寸。一个典型的合成 过程如下：
[0033] 24. 75血水，16. 25血己醇和9. 0血氨水充分混合，然后加入20 y L磁性氧化铁纳 米颗粒和20 y L蹄化領量子点，再迅速加入4. 5mL正娃酸己醋和45. 5mL己醇的混合液，揽 拌反应2小时，即生成纳米球。通过磁分离和己醇清洗H次，真空干燥过夜，得到单分散性 良好，尺寸均一的双功能复合纳米球。
[0034] 实施例2:免疫双功能娃基纳米球探针的构建
[0035] 首先对实施例1制备的双功能复合纳米球进行表面改性，具体是将0. 5g纳米球溶 于50血化巧中，