一种快速检测多种致病菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测多种致病菌的方法，更确切地说涉及一种可调制双功能 纳米球制备及其在多种食源性致病菌快速检测的应用，也即所述的双功能复合纳米球，可 W用于医学诊断、食品安全、环境监测等方面。属于微生物检测领域。
【背景技术】
[0002] 细菌性病原体严重危害人类的健康。食源性致病微生物种类繁多，缺乏灵敏、便 捷、特异的快速检测技术，是食品安全无法得到有效保障的主要原因之一。因此开发针对致 病菌的快速、灵敏、可靠的检测方法和现场、便携的检测仪器，是食品安全和国家安全保障 的迫切需要。
[0003] 用传统的微生物选择培养方式来检测致病菌的存在，结果虽然可靠，被视为微生 物检测的金标准。但是，传统的微生物培养法耗时长、步骤繁琐、需要多种培养基和试剂，无 法满足当今社会一些突发事件对微生物现场快速检测的迫切需求。因此基于分子生物学的 各种检测方法应运而生。该些方法概括起来主要有H类；（1)基于链式聚合反应的检测。 此方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测；（2)基于免疫反应的检测。该类方法经济实 用，重现性好，快速，目前大多数食品微生物快速检测的商业化产品的反应原理是基于H明 治免疫分析，即免疫复合物包含固定抗体、祀细菌和二抗标记物。（3)生物传感器。它是与 生物、生物衍生物相关的分析器件、联合或者集成的物理化学传感器或者转换微系统。与传 统的检测方法相比，生物传感器具有体积小、成本低、灵敏度高、选择性及抗干扰能力强和 响应快等优点，在食品安全检测中具有广泛的应用价值，是食品安全检测的一个重要发展 趋势。
[0004] 近年来，很多研究者基于免疫学原理在开发致病菌检测新方法和新器件方面做了 很多有益的探索。Tan课题组（Proc.化tl. Acad. Sci. 2004)使用抗体连接的娃基英光纳米 材料发展了一种快速、超灵敏的原位免疫分析方法，该种方法不需要扩增和富集就能达到 检测单种菌。2009年Pividori课题组（Anal.化em. 2009)利用由石墨-环氧复合物构建了 一种磁传感器，可W通过免疫的方法在富集捕获致病菌的同时，通过电化学检测或者双标 记PCR检测沙口氏菌。该种新方法具有灵敏，快速的优点。然而，该些方法都局限于在一次 分析中检测一种致病菌，并且在检测过程中需要昂贵的仪器设备和较高检测费用。
[0005] 在一次分析过程中同时检测多种细菌的方法更能满足目前快速、灵敏、特异的检 测致病菌的需求，可有效减少时间和节约成本。近年来研究者们发展了多种多元分析的方 法来同时检测2-3种致病菌，如利用复合PCR技术在一次分析中检测多种致病菌；基于核酸 杂交原理的DNA微阵列技术可W检测多种致病菌；利用免疫化学方式包括酶联免疫吸附分 析、免疫磁分离、使用有机染料标记细菌特异性的抗体进行英光分析等。尤其是磁性颗粒具 有粒径小，比表面积大，表面有许多息空键，可W通过共聚、表面改性赋予其表面多种反应 性功能基等优点；同时生物相容性良好，有利于生物分子巧日：酶、核酸、抗体等）的固定；易 于在磁场作用下迅速聚集，所W广泛应用于生物分析领域。
[0006] 据报道，曾有人研制了一种DM微阵列技术，它可w同时检测几种细菌，但是DM 阵列多局限于一定数量阵列的构建。Magliulo等人（J. Agric. Food化em. 2007)发展了 一种简单快速的复合H明治酶免疫分析方法，可用来同时检测四种细菌。他们使用96孔 聚苯己帰微滴定板，每个孔内包含四个亚孔，将四种细菌相应的单克隆抗体固定在亚孔上。 加入待测样品后，细菌能够特异性的结合在相应的亚孔上，随后加入与四种细菌相应的辣 根过氧化酶（HRP)标记单克隆抗体的混合物，通过一种化学发光低光电成像器件就可W检 测HRP活性。该种方法简单快速，对于每种细菌的检测限都在10 4-l〇5CFU/mL。Tan课题组 (Biocon化gate化em. 2007)基于二氧化娃英光纳米颗粒发展了一种能够监测复杂致病菌 样本的新方法，使用多彩英光能量共振转移检测时间不超过30min。通过改变包埋在二氧化 娃纳米材料内部H种染料的比例，得到在一种单一激发波长下发出唯一颜色的纳米颗粒。 然后与H种致病菌的单克隆抗体结合识别相应的致病菌。该种方法灵敏快速，特异性好，然 而该种纳米颗粒的制备方法局限了只能检测H种致病菌，且纳米颗粒的用量非常高(颗粒/ 细菌=10000/1)。2006年Durst课题组（Talanta2006)发表了基于Protein G-脂质纳米 囊泡的阵列免疫分析方法同时检测H种致病菌(肠出血性大肠杆菌、沙口氏菌、单核细胞增 生李斯特氏菌)。在纯培养液中H种细菌的检测限分别在100、500和1. 2X 105CFU/mU而在 混合培养液中分别是 3. IX 103、7. 8X 104、7. 9X l〇5CFU/mL。
[0007] 利用量子点进行致病菌的检测也是近年来新兴的一类检测方法。量子点又称半 导体纳米微晶体，是一种由II -VI族或III- V族元素组成的能够接受激发光产生英光的半 导体纳米颗粒，其颗粒直径一般约为1-100皿。由于其具有独特的量子尺寸效应和表面效 应，表现出优良的光谱特征和光化学稳定性。利用量子点进行英光标记，相比传统的有机 染料分子具有许多优点，其特征为：（1)量子点的激发光谱较宽且呈连续分布，而发射光谱 宽度狭窄且呈对称分布，可W减少光谱重叠，使同时区分多重英光团成为可能。由于其颜 色可调，即不同大小的量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光，其发射波长从 400nm-2 y m不等，可W用于构建能同时检测多组分的英光探针分析测试体系量子点英光探 针英光效率高，光化学稳定性强，英光强度比最常用的有机染料罗丹明6G高20倍W上，稳 定性是其的100倍W上。（2)生物相容性好。通过量子点的表面与多种生物分子结合，可获 得多种功能基团，使生化分析更加灵活。（3)发光半导体量子点材料具有很好的非线性光学 性质，可W探针进行深入的非侵害性的标记。基于抗原抗体结合原理，2005年Hahn等用链 酶亲和素修饰的量子点英光抗体探针检测0157 : H7,其检测灵敏度比使用普通有机英光 染料探针要高出两个数量级，且英光发光时间达到数小时，远优于普通染料的数砂发光。同 时由于链亲和素-生物素体系的放大作用，进一步提高了检测灵敏度，实现了单细胞的检 巧IJ。2008年Hahn等又进一步采用流式细胞技术对息液中致病性0157 : H7和非致病性大 肠埃希菌进行了检测。2006年Li等人利用两种不同尺寸的量子点标记，结合免疫磁珠同时 对两种致病菌的进行检测。尽管在多种致病菌检测方面已经出现了很多新方法，但是在如 何提高检测灵敏度和缩短检测时间方面，仍然是亟待解决的问题。
[0008] 通常，复合纳米结构是指包含两种或两种W上的功能纳米材料，它代表了一类重 要的多功能纳米系统。将量子点和磁性纳米颗粒组合成复合纳米结构不仅可W阻止超顺磁 纳米颗粒聚集，还能够减轻量子点的生物毒性，同时兼具量子点和磁性纳米颗粒的优良性 能，从而有望为多种致病菌灵敏快速检测提供了新的思路和途径。本发明试图借鉴上述思 路，提供一种快速检测多种致病菌的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种快速检测多种致病菌的方法，所述方法包括是双功能 复合纳米球的制备，所述的双功能复合纳米球是首先采用二氧化娃同时包埋不同尺寸的量 子点和磁性纳米颗粒，构建多种具有不同光学特性和超顺磁性的复合纳米球。然后，双功能 复合纳米球表面改性后分别将不同尺寸的量子点和复合双功能纳米球与具有特异特性识 别目标菌的单克隆抗体连接，得到几种能够与目标菌表面抗原进行抗原-抗体反应的免疫 量子点探针和免疫复合纳米球探针。该种免疫复合结构的纳米球探针既可W作为免疫识别 分离多种致病菌的载体，又可W作为免疫量子点探针的信号增强子，实现检测信号的二次 放大，通过在相应波长下检测其光学强度就可W实现多种致病菌（目标微生物）的检测。此 方法通过磁性纳米颗粒免疫分离和量子点"双重标签"的信号扩增效应，能够大大缩短检