人血清中c肽含量的检测方法及其用试剂盒和试剂盒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验学领域，具体涉及一种用于临床测定人血清中C肤含量的试 剂盒，该试剂盒的制备方法W及利用该试剂盒检测人血清中C肤含量的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组由膜岛素分泌绝对或相对不足所导致的W慢性高血糖为特征的代 谢综合征。近30年来，我国糖尿病患病率显著增加。根据中华医学会糖尿病学分会（CDS)的 调查结果，2007至2008年，我国20岁W上的成年人糖尿病患病率为9. 7%，另外还有月1482 万成年人具有前驱糖尿病症状，约占总人口数的1. 55%。目前临床诊断筛查中，血清C肤和 膜岛素水平对糖尿病的分型诊断、治疗方案选择和疗效监测具有重要的临床参考意义，是 筛查诊断糖尿病患者主要的常规必检项目。在体内，C肤（c-p巧tide)与膜岛素（insulin) 均来自于膜岛目细胞的分泌产物膜岛素原，一个分子的膜岛素原经酶切后，裂解成一个分 子的膜岛素和一个分子的C肤。二者W等分子数共存于分泌颗粒，并同时释放至毛细血管 循环中，且C肤不被肝脏破坏，半寿期较膜岛素明显为长。治疗用的膜岛素不含C肤，因此， 测定血循环中C肤水平，能更好的反映膜岛目细胞合成与释放膜岛素的功能。
[0003]目前临床上检测C肤主要采用化学发光法和酶联免疫法，极少数还在使用放射免 疫分析方法。化学发光法检测必须使用化学发光仪。酶联免疫法必须使用酶标仪进行检测， 两种方法检测时间长(一般30分钟W上)，且检测设备复杂昂贵，必须配备专人负责操作，从 而导致检测费用也较为昂贵；而放射免疫分析方法需要使用放射性标记物，不仅需配备专 用放射性探测器对检测结果进行测定，也易对操作人员造成放射性污染和伤害，此外，该方 法常用的1-125, 1-131，P-32等放射性元素，由于其半衰期短，导致试剂保存时间也短，在 临床使用上非常不便。
[0004] 胶乳颗粒增强免疫比浊法测定试剂盒是利用抗原、抗体特异结合的免疫学原理， 将单克隆或多克隆抗体分别结合到胶乳颗粒上，病人血清(或标准品）中的抗原在缓冲液 中与胶乳表面的抗体结合，从而使胶乳颗粒彼此交联致使溶液浊度增加，并在一定范围内 反应液浊度与所加抗原的量呈线性相关，因此可使用生化分析仪(或其他光学检测仪器）在 一定波长处测定反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测抗原浓度呈正比。使用已知浓度 的标准品绘制曲线，即可根据被测标本的反应吸光度变化计算出抗原的浓度。胶乳颗粒增 强免疫比浊法无需配备专用仪器，可在一般医疗检测机构都具有的生化分析仪上使用，灵 敏度高、稳定性好、特异性强，且该方法检测时间短，检测成本低，不存在放射性污染的问 题。然而，由于制备难度较高，目前还没有胶乳颗粒增强免疫比浊法的商业化C肤测定试剂 盒，也没有应用胶乳颗粒增强免疫比浊法来测定人体血液中C肤含量的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种操作方便、价格低廉、 可用于临床测定人血清中c肤含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其制备方法w及利用该 试剂盒来检测人血清中C肤含量的方法，解决目前临床应用中C肤检测时间长、检测成本 高、存在放射性污染的问题。
[0006] 为解决W上技术问题，本发明采取的一种技术方案是：
[0007] -种测定血清中C肤含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，所述试剂盒包括第一试 剂、第二试剂和校准品，其中：
[0008]所述第一试剂的抑为7~8,包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强 剂W及防腐剂；
[0009]所述第二试剂的抑为7~8,包含缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂W及包被抗 人C肤抗体的致敏聚苯己帰胶乳颗粒，其中，所述包被抗人C肤抗体的致敏聚苯己帰胶乳颗 粒的粒径为40~500nm，通过将比原始亲代抗体高至少20倍的结合亲和力的C肤单克隆 和/或多克隆抗体Fab片段标记到表面经过駿基化或氨基化基团修饰的聚苯己帰胶乳颗粒 上得到，所述第二试剂中的所述包被抗人C肤抗体的致敏聚苯己帰胶乳颗粒的质量含量为 0. 3% ~0. 5% ;
[0010] 所述校准品的抑为7~8,包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和人C肤蛋 白。
[0011] 根据本发明，所述的C肤单克隆和/或多克隆抗体可W是羊源、兔源及鼠源中的一 种或多种的组合。所使用的单克隆抗体可W为几种，多种抗人C肤单克隆抗体混合可W识 别更多的抗原表位，从而在保证试剂盒特异性的同时提高试剂盒的灵敏度；本发明使用的 高亲和力C肤单克隆抗体或多克隆抗体可W购买或根据已知方法自巧||，单克隆抗体可购自 芬兰Medix Biochemica公司，多克隆抗体可购自美国Abeam公司或美国Abbiotec公司。
[0012] 进一步地，所述第一试剂、第二试剂W及校准品中，电解质的质量含量分别为 3%~6%，表面活性剂的质量含量分别为0. 8%~1. 2% ;第一试剂、校准品中，稳定剂的质量 含量分别为0. 1%~0. 3% ;第二试剂、所述校准品中，防腐剂的质量含量分别为0. 005%~ 0. 02% ;第一试剂中的反应增强剂的质量含量为2%~6%。
[0013]根据本发明，所述第一试剂、第二试剂W及校准品中所含的缓冲液可W独立地为 选自Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、肥PES缓冲液、磯酸缓冲液、测酸盐缓冲液及PIPES缓 冲液中的一种；所述第一试剂、第二试剂中所含有的电解质为无机盐；所述第一试剂、第 二试剂W及校准品中所含的表面活性剂可W独立地为选自Tween20、Tween40、Tween60、 TritonX-100、Span40及SpanSO中的一种或多种的组合；所述第一试剂、校准品中所含的稳 定剂可W独立地为选自蛋白质、金属馨合剂、混息剂及抗氧化剂中的一种或多种的组合。
[0014]优选的，所述无机盐为氯化轴、氯化镇或氯化镇；所述蛋白质为小牛血清、牛血清 白蛋白或明胶；所述金属馨合剂为邸TA、EGTA、邸TP或DTPA ;所述混息剂为藏糖、麦芽糖、乳 糖、己二醇或丙H醇。
[0015] 根据本发明，反应增强剂可W为选自聚己二醇2000、聚己二醇4000、聚己二醇 6000、聚己二醇8000及聚凝胺中的一种或多种的组合。
[0016]根据本发明，第一试剂、校准品中所含的防腐剂可W独立地为选自叠氮轴、山梨酸 钟、苯甲酸轴、亚硝酸轴及Proclin300中的一种或多种的组合。
[0017]根据本发明，优选采用表面经駿基化的聚苯己帰胶乳颗粒。致敏聚苯己帰胶乳颗 粒是通过交联剂将胶乳颗粒表面基团活化后再进行抗人c肤抗体的包被。駿基化的胶乳颗 粒通过碳二亚胺（EDC或邸AC)进行活化，氨基化的胶乳颗粒通过戊二酵进行活化。
[0018]根据本发明，所述第二试剂中的所述包被抗人C肤抗体的致敏聚苯己帰胶乳颗 粒的质量含量优选为0. 1%~1% ;
[0019]根据本发明，所述校准品中的人C肤蛋白可W是重组、膜岛素原纯化或化学合成 中的一种或几种。
[0020] 本发明采取的又一技术方案是：一种上述的测定血清中C肤含量的胶乳增强免疫 比浊试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：
[0021] (1)、分别配制第一试剂和校准品；
[0022] (2)、制备第二试剂：首先进行胶乳活化，然后向活化后的胶乳中加入所述高亲和 力C肤单克隆和/或多克隆抗体进行标记，加入比例为2~6mg抗体每毫升胶乳，标记后， 加入封闭缓冲液进行封闭，标记并封闭好的胶乳经清洗复溶得到胶乳原液，最后进一步对 胶