一种快速检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，设及一种基于核酸适体的生物传感巧片，特别 为一种基于核酸适体的快速检测鼠伤寒沙口氏菌的生物传感巧片及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 鼠伤寒沙口氏菌，是一群非适应性或泛嗜性的沙口氏菌，具有广泛的宿主，是目前 世界各国分离率最高的菌型之一。该菌自然疫源广泛，很多家禽、家畜、鼠、鸟和冷血动物是 自然宿主，蛹、圣可带菌传播，常由污染的水、牛奶和食物经口感染。人感染沙口氏菌后，可 呈无症状带菌，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，严重威胁着 人们的身体健康。因此鼠伤寒沙口氏菌的临床快速诊断具有重要的公共卫生意义。
[0003] 为了有效预防沙口氏菌病，人们在探索沙口氏菌检测方法的过程中，做出了不懈 的努力，特别是在生物化学（GB/T 4789)、免疫学（Appl. Environ. Microbiol. January 2004 vol. 70 no. 1 152-158)、分子生物学（Letters in Applied Microbiology, Volume 42， Issue 2, pages 149-154, February 2006)等方面，开发出了各种新型快速检测技术，提高 了沙口氏菌检测的速度和质量，有效预防和控制沙口氏菌的传染。由于其样品来源极为繁 杂，尽管各国学者对其进行了长期研究，仍存在不少问题。目前主要存在分析过程复杂、分 析时间长、检测灵敏度较低等缺点。
[0004] 核酸适体（Aptamer)是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELE)〇,从核酸分子文库中得到的 一段脱氧核糖核酸值NA)或者核糖核酸（RNA)序列。核酸适体具有与传统免疫分析的抗 原-抗体性质类似的性能，能与特定目标物质高特异性、高选择性地结合，并且比传统的抗 体具有更好的稳定性，因此近年来被广泛应用于生物传感器领域。
[0005] 当光线入射到由贵金属构成的纳米颗粒上时，如果入射光子频率与贵金属纳米 颗粒或金属岛传导电子的整体振动频率相匹配时，纳米颗粒或金属岛会对光子能量产生 很强的吸收作用，就会发生局域表面等离子体共振（LSPR;localized Su计ace Plasmon Resonance)现象，LSPR吸收谱还对周围介质极其敏感，因此可W作为基于光学信号的化学 传感器和生物传感器。基于LSPR现象的传感器可W做到无需标记，并且是无污染、实时、高 灵敏度的检测，可W广泛用于药物研究、生物检测、细胞标记、定点诊断、分子动力学研究及 疾病诊断等方面。迄今为止，还没有基于核酸适体与LSH?检测技术相结合来定量检测鼠伤 寒沙口氏菌的相关产品或文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术存在的缺陷，目的在于提供一种基于核酸适体的快速检测鼠 伤寒沙口氏菌的生物传感巧片，其具有特异性好、灵敏度高、快速有效的特点。
[0007] 本发明具体通过W下技术方案实现：
[000引一种快速检测鼠伤寒沙口氏菌的生物传感巧片，通过将核酸适体固定于修饰有金 纳米椿的巧片，所述的核酸适体基因序列为TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGAC AG。
[0009] 本发明所述的核酸适体末端修饰有琉基。
[0010] 本发明所述的一种快速检测鼠伤寒沙口氏菌的生物传感巧片具体通过W下方法 制备：
[0011] 1)金纳米椿的制备；制备长径比为3~5的金纳米椿；
[0012] 2)金纳米椿在巧片上的固定；
[0013] a.巧片的清洗；将巧片浸入体积比为3 : 1的浓硫酸与过氧化氨的混合溶液中氧 化，在室温20KHz条件下超声15min。
[0014] b. 3-氨丙基=己氧基硅烷的修饰；将清洗后的巧片浸入3-氨丙基=己氧基硅烷 的甲醇溶液中，静置反应比，用甲醇和去离子水反复冲洗3次后于110°C下烘干化；
[0015] C.聚苯己締横酸钢的修饰；将烘干的巧片浸入聚苯己締横酸钢水溶液中，静置反 应 90min ;
[0016] d.金纳米椿的修饰；将修饰有聚苯己締横酸钢的巧片浸入步骤（1)中制备的金纳 米椿溶液中，静置反应90min。
[0017] 3)核酸适体的固定；将得到的巧片浸入末端修饰有琉基的核酸适体溶液中，静置 反应2化。
[001引所述的过氧化氨的质量分数> 30%，所述的3-氨丙基=己氧基硅烷的甲醇溶液 的质量分数为10 %，所述的聚苯己締横酸钢水溶液的浓度为50g/l，所述的核酸适体溶液 的浓度为0.1 mM。
[0019] 本发明所述的生物传感巧片用于检测鼠伤寒沙口氏菌的应用，所述的生物传感巧 片采用手提式光纤光谱仪进行检测，使用透射模式检测巧片，结合样品前后的光谱，计算获 得鼠伤寒沙口氏菌的浓度。
[0020] 本发明的有益效果为；1)快速检测鼠伤寒沙口氏菌。整个检测过程可W在一个小 时内完成。而传统的鼠伤寒沙口氏菌检测方法常常需要经过较长的细菌培养及样品前处理 过程；2)核酸适体直接结合细菌，无需对细菌进行破碎等前处理；3)检测设备简单，只需要 一台手提式光谱仪即可。适合携带到现场对食品及环境样品进行检测。
【附图说明】
[0021] 图1是检测水样中鼠伤寒沙口氏菌含量的光谱图；
[0022] 图2是本发明实施例检测鼠伤寒沙口氏菌的标准工作曲线；
[0023] 图3是本发明实施例检测甲型副伤寒沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增 李斯特菌、宋内氏志贺氏菌及鼠伤寒沙口氏菌的影响图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，W下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0025] 实施例1生物传感巧片的制备
[0026] 一种基于核酸适体的快速检测鼠伤寒沙口氏菌的生物传感巧片，具体通过W下步 骤制备：
[0027] 1)金纳米椿的制备；义用晶种生长法制备，具体制备方法如下：
[0028] A.将十六烷基S甲基漠化锭（CTAB)溶液巧血，0. 2M)加入15血的玻璃瓶中，放在 30 °C的水浴锅中，磁力揽拌。
[0029] B.往玻璃瓶中加入4. 75血的水和0. 25血0. 01M的HAuCL溶液。
[0030] C.调节磁力揽拌机转速为12(K)r/min，将新制冷冻的0. 6血NaBH加入到上述溶 液中，溶液呈栋黄色。
[0031] D.持续揽拌两分钟后，停止揽拌，将磁力揽椿子从溶液中取出，将此反应液静置于 30°C水浴中30min备用。（制备得到的金核溶液必须在化使用）
[003引 E.将CTAB溶液（12. 5血，0. 2M)加入25mL的比色管中，再加入9. 675血的水，使 CTAB溶解完全。
[003引 F.往上述溶液中加入0. 15血0. 01 MgN03溶液，混合均匀，静置5min，随后加入 l.OmL lOmM 的 HAuCL溶液。
[0034] G.剧烈上下振摇反应液后，并加入1. 6血0. 01M的抗坏血酸（VC)，混合均匀后，加 入50yL的金核。剧烈震荡20s后，室温静置化。
[0035] 2)金纳米椿在巧片（此处选取22mmX 22mm的盖玻片作为基质）上的固定，包括W 下四个步骤：
[0036] A.盖玻片的清洗：将盖玻片浸入体积比为3 : 1的浓硫酸（98%