免疫特征分析:通向早期诊断和健康监测的途径的制作方法
【专利说明】免疫特征分析：通向早期诊断和健康监测的途径 夺叉引用
[0001] 本申请要求2012年8月29日提交的、名称为"免疫特征分析：通向早期诊断和健 康监测的途径"的美国临时申请号61/694, 598的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
[0002] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如 同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
【背景技术】
[0003]监测个体的健康是一个巨大的挑战。状况的早期检测可能对疾病的结果具有显著 影响，然而，对于大多数状况，并不存在可在主要症状出现前检测出疾病的单一测试。许多 研宄小组曾尝试开发可以诊断特定状况的测试；然而此类测试仅限于特定疾病或诊断。此 外，对目前可用的诊断测试而言，在一段时间内监测健康耗费太多的成本和时间。
【发明内容】
[0004] 本文公开了用于监测受试者的健康的方法、阵列和试剂盒。在本文公开的实施方 案中，本发明提供了一种快速、稳健且可再现的健康监测方法，从而允许在一段时间内监测 个体的健康。在一些实施方案中，该方法包括：a)使复杂生物样品与肽阵列接触，其中所述 肽阵列包含能够脱靶结合所述生物样品中的至少一种抗体的不同的肽；b)测定所述抗体 与所述肽阵列中的多个不同的肽的脱革G结合以形成免疫特征（immunosignature);以及c) 将所述免疫特征与健康状态相关联。
[0005] 在一些实施方案中，本发明提供了一种提供治疗的方法，该方法包括：a)接收来 自受试者的复杂生物样品；b)使所述复杂生物样品与肽阵列接触，其中所述肽阵列包含能 够脱靶结合所述生物样品中的至少一种抗体的不同的肽；c)测定所述抗体与多个不同的 肽的脱靶结合以形成免疫特征；d)将所述免疫特征与状况相关联；以及e)提供针对所述状 况的治疗。
[0006] 在一些实施方案中，本发明提供了一种预防状况的方法，该方法包括：a)提供来 自受试者的复杂生物样品；b)使所述复杂生物样品与肽阵列接触，其中所述肽阵列包含能 够脱靶结合所述复杂生物样品中的至少一种抗体的不同的肽；c)测定所述复杂生物样品 与多个不同的肽的脱靶结合以形成免疫特征；d)将所述免疫特征与状况相关联；以及e)接 受针对所述状况的处理。
[0007] 在一些实施方案中，本发明提供了一种诊断方法，该方法包括：a)接收来自受试 者的复杂生物样品；b)使所述复杂生物样品与肽阵列接触，其中所述肽阵列包含能够脱靶 结合所述生物样品中的至少一种抗体的不同的肽；c)测定所述抗体与所述肽阵列中的多 个不同的肽的脱靶结合以形成免疫特征；以及d)基于所述免疫特征诊断状况。
[0008] 在一些实施方案中，本发明提供了一种用于接收、记录（log)和稀释来自受试者 的生物样品的系统。在一些实施方案中，用于接收、记录和稀释来自受试者的生物系统的系 统是完全自动化的。
[0009] 在一些实施方案中，一种免疫特征分析（immunosignaturing)系统包含自动化装 置，该自动化装置由下列组件组成：1)用于接收、记录和稀释来自受试者的生物样品的自 动化系统；2)用于自动化的免疫特征分析测试的隔室，所述免疫特征分析测试包括：a)将 稀释的样品施加至肽阵列，b)孵育特定时间，c)洗涤并除去未结合的样品，d)施加第二抗 体溶液特定时间，e)除去第二抗体，以及f)干燥并扫描所述阵列，以测定各个斑点的荧光； 以及3)用检测器检测所述荧光。
[0010] 本文提供了用于产生可与本文所述的免疫特征测试结合使用的新型阵列的方法 和装置。在一些实施方案中，制造所述阵列以减少在阵列上生成杂聚物所必需的图案化步 骤的数目。在其他实施方案中，本文公开的方法和装置采用新型图案化算法来同时添加多 个单体。在一些实施方案中，本文公开的算法可显著减少合成大阵列所需的图案化步骤的 数目，从而导致更低的成本和更短的制造时间。
[0011] 在一些实施方案中，本文公开的方法和装置提供了一种阵列，该阵列包含多个固 定至固体支持体上不同位置的、原位合成的具有可变长度的聚合物，其中聚合物的原位合 成包括以下步骤：将第一单体添加至所述固体支持体上预定部分的位置；将第二单体添加 至所述固体支持体上预定部分的位置，其中用于第二单体的预定部分的位置包括含有第一 单体的位置和不含单体的位置；将第三单体添加至所述固体支持体上预定部分的位置，其 中用于第二单体的预定部分的位置包括含有第一和第二单体的位置、含有第二单体的位置 以及不含单体的位置；以及用限定的一组单体重复步骤a- c，直到所述聚合物达到所期望 的平均长度并且所述部分的总和总计至少为100%。
[0012] 在其他实施方案中，本文公开的方法和装置还提供了一种制造阵列的方法，该阵 列包含多个固定至固体支持体上不同位置的、原位合成的具有可变长度的聚合物，该方法 包括以下步骤：提供基底作为在其上合成聚合物的固体支持体；将第一单体添加至所述固 体支持体上预定部分的位置；将第二单体添加至所述固体支持体上预定部分的位置，其中 用于第二单体的预定部分的位置包括含有第一单体的位置和不含单体的位置；将第三单体 添加至所述固体支持体上预定部分的位置，其中用于第二单体的预定部分的位置包括含有 第一和第二单体的位置、含有第二单体的位置以及不含单体的位置；以及用限定的一组单 体重复步骤b-d，直到所述聚合物达到所期望的平均长度并且所述部分的总和总计至少为 100%〇
[0013] 在另外的其他实施方案中，本文公开的方法和装置提供了一种使用本文所述的阵 列来监测受试者的健康状态的方法，该方法包括以下步骤：从所述受试者采集生物样品； 将所述生物样品与所述阵列杂交；确定所述样品中与所述阵列杂交的成分；评估杂交程 度；以及确定所述受试者的健康状态。所公开的阵列可用于产生如本文所述的免疫特征，而 且还可用于使用微芯片阵列确定复杂生物样品中靶标的结合活性的其他诊断和治疗测试。
[0014] 在一些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒。试剂盒可包含用于从受试者抽取 少量血液的手指刺破装置和用于收集血液样品的接收表面。在一些实施方案中，该试剂盒 包含关于其使用的书面说明。
【附图说明】
[0015] 图1为测试#1中的组间和组内相对差异的视觉表示。对120个肽和120个患 者样品中的每一个的值作图，蓝色指示低结合而红色指示高结合。使用欧几里德距离 (Euclidean distance)作为相似性度量的分级聚类用来对肽（Y轴）和患者（X轴）进行聚 类（cluster)。最左边的层级就是基于这种聚类。
[0016] 图2示出了来自测试#1的样品的热图。A图示出了使用120个选定特征（feature) 的训练数据集的热图。B图示出了使用相同的120个肽进行聚类的未混合的测试数据。
[0017] 图3示出了来自测试#2的样品的热图。1516个样品（X轴）与255个预测肽（Y 轴）中的每一个的值一起示出。每种疾病与患者总数（在括号内注明）一起列出。
[0018] 图4为测试#1的受试者工作特征（R0C)曲线的图形表示。针对来自测试#1的测 试数据的各个疾病组群（cohort)，计算灵敏度和特异性。对于每个分类算法，针对每种疾病 绘制单独的R0C曲线并计算曲线下面积（AUC)值。SVM的AUC以灰色显示。A图为针对乳 腺癌的SVM图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。B图为针对脑癌的SVM图的特异性/灵 敏度AUC的图形表示。C图为针对食管癌的SVM图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。D 图为针对多发性骨髓瘤的SVM图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。E图为针对健康对照 的SVM图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。F图为针对胰腺癌的SVM图的特异性/灵敏 度AUC的图形表示。
[0019] 图5为测试#1的受试者工作特征（R0C)曲线的图形表示。PCA的曲线下面积（AUC) 以灰色显示。A图为针对乳腺癌的PCA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。B图为针对 脑癌的PCA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。C图为针对食管癌的PCA图的特异性/ 灵敏度AUC的图形表示。D图为针对多发性骨髓瘤的PCA图的特异性/灵敏度AUC的图形 表示。E图为针对健康对照的PCA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。F图为针对胰腺 癌的PCA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。
[0020] 图6为测试#1的受试者工作特征（R0C)曲线的图形表示。NB的曲线下面积（AUC) 以灰色显示。A图为针对乳腺癌的NB图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。B图为针对脑 癌的NB图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。C图为针对食管癌的NB图的特异性/灵敏 度AUC的图形表示。D图为针对多发性骨髓瘤的NB图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。 E图为针对健康对照的NB图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。F图为针对胰腺癌的NB 图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。
[0021] 图7为测试#1的受试者工作特征（R0C)曲线的图形表示。LDA的曲线下面积（AUC) 以灰色显示。A图为针对乳腺癌的LDA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。B图为针对 脑癌的LDA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。C图为针对食管癌的LDA图的特异性/ 灵敏度AUC的图形表示。D图为针对多发性骨髓瘤的LDA图的特异性/灵敏度AUC的图形 表示。E图为针对健康对照的LDA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。F图为针对胰腺 癌的LDA图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。
[0022] 图8为测试#1的受试者工作特征（R0C)曲线的图形表示。k-NN的曲线下面积 (AUC)以灰色显示。A图为针对乳腺癌的k-NN图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。B图 为针对脑癌的k-NN图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。C图为针对食管癌的k-NN图的 特异性/灵敏度AUC的图形表示。D图为针对多发性骨髓瘤的k-NN图的特异性/灵敏度 AUC的图形表示。E图为针对健康对照的k-NN图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。F图 为针对胰腺癌的k-NN图的特异性/灵敏度AUC的图形表示。
[0023] 图9为四个分类器（classifier)的图形表示。A图为PCA的图形表示，对前两个 主分量作图。B图为LDA的图形表示，X和Y轴描绘了前两个线性判别量（discriminant)。 C图为NB的图形表示，对预测变量作图。D图为k-NN的图形表示，对组间距离（groupwise distance)作图。
[0024] 图10为来自测试#2的255个分类器肽中的3个分类器肽的线型图。该强度谱在 X轴上显示了个体，疾病用空格隔开，并且在Y轴上显示了各个肽的log 1(l强度。A图示出了 对疾病6和9为高而对所有其他疾病为低的肽的线型图。B图示出了对疾病11为高的肽的 线型图。C图示出了对疾病1和部分疾病9为高的肽。
[0025] 图11为示出了可与本发明的示例实施方案结合使用的计算机系统的第一示例架 构的框图。
[0026] 图12为示出了可与本发明的示例实施方案结合使用的计算机网络的示意图。
[0027] 图13为示出了可与本发明的示例实施方案结合使用的计算机系统的第二示例架 构的框图。
[0028] 图14示出了具有不同肽密度的本发明的示例性阵列。
[0029] 图15为示出了多名受试者在接受流感疫苗后一段时间内的免疫特征谱的热图。
[0030] 图16为示出了免疫特征分析结合模式的热图。A图示出了在1天的过程中来自同 一受试者的不同生物样品的免疫特征。B图示出了 A图的一部分的特写图。
[0031] 图17为示出了在数月内监测的1名受试者的免疫特征分析结合模式的热图。
[0032] 图18为示出了 3名受试者在21天的时程中的免疫特征分析结合模式的热图。A 图示出了当检测到IgM免疫球蛋白的结合时，具有约10, 000个肽的肽微阵列的聚类。B图 示出了当检测到IgM免疫球蛋白的结合时，具有50个个人肽（personal peptides)的肽微 阵列的聚类。C图示出了当检测到IgG免疫球蛋白的结合时，具有约10, 000个肽的肽微阵 列的聚类。D图示出了当检测到IgG免疫球蛋白的结合时，具有50个个人肽的肽微阵列的 聚类。
[0033] 图19为示出了采用免疫特征分析结合模式分析对两名受试者进行的30天健康监 测分析的热图。
[0034] 图20为示出了在30天时程中的第17天接受流感疫苗的受试者的免疫特征分析 结合模式的热图。在不同的时间范围（time-frame)上示出了该受试者对22个所选肽序列 的免疫特征分析结合谱。
[0035] 图21为示出了在图20中表征的受试者在2013年3月5日被诊断为支气管炎的 热图。
[0036] 图22为示出了在图20中表征的受试者在2011年12月11日被症状后诊断为流 感的热图。
[0037] 图23为示出了接受肝炎疫苗治疗并在此后3个月接受第一次加强治疗的受试者 的免疫特征分析结合模式的热图。
[0038] 图24示出了多种传染病的分类的汇总。A图为示出了登革热、西尼罗病毒（WNV)、 梅毒、乙型肝炎病毒（HBV)、正常血液、溪谷热和丙型肝炎病毒的聚类免疫特征分析结合谱 的热图。B图为PCA分类的图形表示。
[0039] 图25为本发明的免疫特征分析系统的组件的示意图。
[0040] 图26 :A图不出了嗤囷体展不文库。B图不出了狀微阵列。
[0041] 图27示出了作为图案化步骤数的函数的合成肽的平均长度。X轴为图案化循环的 数目，而Y轴为平均肽长度。通过使用任意数目的图案化循环，本文公开的图案化算法将图 案化步骤减少了几乎2倍。
[0042] 图28示出了使用标准的逐层法（layer by layer approach)与新型图案化算法 相比，通过以单体形式施加所有20种氨基酸而产生的结果。
[0043] 图29示出了免疫特征分析实施方案的结果，在该实施方案中用少于60个步骤即 获得平均12个残基的长度。
[0044] 图30示出了使用16种不同的氨基酸由优化算法的70个步骤产生的分布。
[0045] 图31示出了在肽阵列产生后选择的肽的长度分布。
[0046] 图32为示出了 3个、4个或5个氨基酸长的可能序列的分布的图。
[0047] 图33示出了对于所选择的肽文库，作为肽中的位置的函数的氨基酸组成。 发明详沭
[0048] "健康"是一种复杂的状态，其代表了几乎所有人类活动和交互的不断变化的结 果。这使得难以定量地定义健康状态。必须系统性地测量数以千计的生化和物理属性。健 康监测中的一大挑战是受试者对各种刺激的响应的复杂性。大多数生物每天暴露于多种不 同的刺激，然而一些生物具有能够响应于此类刺激并防止引发或形成疾病的生物结构和过 程的系统。为了适当地行使功能，此类系统必须检测很多种刺激，如病毒或寄生虫的存在， 并在体内引发针对这些物质、异常细胞和/或组织的响应。
[0049] 健康监测中的一个必然的挑战是受试者对复杂刺激的响应的复杂性。例如，由自 身体内的病变细胞产生的生理响应可以不同于对感染的生理响应。然而，检测、处理、识别 和作用于例如感染或癌症的早期体征的能力可对受试者的健康具有显著影响。如果在肿瘤 细胞有时间繁殖、抑制免疫系统、形成转移性集落并造成组织损伤前诊断出癌症，则人们可 有望更有利地对治疗作出响应。
[0050] 类似地，如果在感染后不久检测出受试者体内存在病原体，则可在宿主炎症阻止 侵入物进入之前以及在病原体负荷变得在免疫上具有压倒性优势之前施用抗微生物剂。如 果早期检测到诸如狼疮的自身免疫疾病，而自身抗体水平低，则用以减弱免疫爆发的治疗 可能有效得多。幸运的是，免疫系统持续监测受试者的健康状态。然而，用于健康监测和早 期检测的稳健、可靠且有效的方法仍然是一个尚未得到满足的需求。
[0051] 免疫特征分析是微阵列和噬菌体技术的结合体，其展示了体液免疫应答的复杂性 并将其转化成机器可读的、定量的形式。免疫特征分析在早期准确地检测健康状态的甚至 微小的扰动。对于抗体组库（repertoires)的这些综合性测量提供了用于快速、廉价及早 期诊断任何患病状态的手段；最终，对免疫特征的持续监测可提供在症状出现之前检测危 险疾病状态的手段。