细胞表面标志分子用于检测肝癌循环肿瘤细胞的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞表面标志分子用于检测肝细胞肝癌循环肿瘤细胞的用途，具体涉 及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGPR) 1/2和/或细胞角蛋白组合（cytokeratins，CK) 8/18/19在检测肝细胞 肝癌循环肿瘤细胞中的用途。
【背景技术】
[0002] 肝癌发病率和死亡率分别占全球恶性肿瘤第五和第二位，年死亡人数与新发病例 数几乎相同，约60万。肝癌也是我国常见恶性肿瘤，发病率和死亡率分别占我国恶性肿瘤 第三和第二位，其中肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌的主要类型，约 70%死于肿瘤的转移复发。目前肝细胞肝癌以外科治疗为主，如肿瘤切除术和肝移植术，主 要问题为术后转移复发。
[0003] 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs)是从上皮来源的实体肿瘤脱落， 进入外周血的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞会随血流迁移到达合适的微环境，种植于远处器官， 形成转移灶。
[0004] 检测循环肿瘤细胞有助于发现早期微转移灶，可以用来动态监测肿瘤病情的发 展，为评估患者预后及监测临床治疗效果提供参考信息。既往研究表明存在于外周血中的 循环肿瘤细胞与较高的复发危险程度相关，现主要用于转移性乳腺癌、前列腺癌、结肠癌的 临床检测，以辅助预后评估。
[0005] 目前从外周血中检测循环肿瘤细胞的技术依照对象分为检测肿瘤细胞核酸和检 测肿瘤细胞自身。肿瘤细胞核酸检测技术依赖于针对肿瘤细胞特异的DNA序列设计的 RT-PCR和qPCR方法，假阳性率高，稳定性差；基于肿瘤细胞的检测技术依赖于肿瘤细胞表 面特异表达的蛋白标志，富集肿瘤细胞后用细胞病理学的金标准直观地观察肿瘤细胞的形 态，而成为循环肿瘤细胞鉴定的主流方法之一。CellSearch?系统自2004年以来被美国食 品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA)先后批准用于转移性乳腺癌、前 列腺癌、结肠癌患者外周血循环肿瘤细胞检测，该方法也于2012年8月被我国食品药品监 督管理局（China Food and Drug Administration, CFDA)批准用于转移性乳腺癌患者外周 血循环肿瘤细胞的检测。CellSearch?系统的基本原理是基于捕获和富集外周血中带有上 皮细胞表面标记上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)的稀有 的肿瘤细胞，将细胞表面带有EpCAM标记（EpCAM+)和细胞角蛋白（cytokeratins，CK) 8、18 及/或19标记（CK+)，排除白细胞表面标记⑶45 (⑶450的有核细胞(细胞核染料4, 6-联 眯-2_苯基吲哚，4, 6-diamidino_2-phenylindole，DAPI+)鉴定为乳腺癌、前列腺癌和结肠 癌的循环肿瘤细胞。
[0006] 然而，该方法不适用于肝细胞肝癌外周血循环肿瘤细胞的检测，因为研究表明：① 仅仅有30%左右的肝癌细胞表面表达EpCAM ;②不仅如此，表达EpCAM的肝细胞肝癌属于外 周血中为数很少的肝癌肿瘤干细胞样细胞,其生物学特性和普通外周血循环肿瘤细胞有很 大区别；③肿瘤具有异质性（heterogenicity)，即由一个克隆来源的肿瘤细胞在生长过程 中形成在侵袭能力、生长速度、对刺激的反应、对抗癌药物的敏感性等方面有所不同的亚克 隆的过程。大约30%的上皮来源肿瘤细胞表面不表达EpCAM，具有异质性；④无论美国的FDA 和中国的CFDA都没有官方授权批准用于检测肝细胞肝癌外周血循环肿瘤细胞的方法。因 此，研究肝细胞肝癌代表性的细胞表面标志分子用以鉴定循环中肝细胞肝癌来源的有核细 胞，即肝细胞肝癌的循环肿瘤细胞非常必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明人经过大量实验研究和反复摸索，找到了适合检测肝细胞肝癌的循 环肿瘤细胞的细胞表面标志分子以及相应的检测方法，由此完成了本发明。
[0008] 本发明第一方面涉及检测细胞表面标志分子的试剂用于制备检测肝细胞肝癌 的循环肿瘤细胞的产品(例如试剂盒）的用途，所述细胞表面标志分子选自细胞表面表 达CK8、CK18、CK19、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3, GPC3)、去唾液酸糖蛋白受体 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR) KASGPR2 中的至少一种。
[0009] 本发明第二方面涉及检测细胞表面标志分子的试剂用于制备诊断或辅助诊断肝 细胞肝癌的产品(例如试剂盒）的用途，所述细胞表面标志分子选自CK8、CK18、CK19、GPC3、 ASGPRl、ASGPR2中的至少一种。
[0010] 本发明第三方面涉及检测细胞表面标志分子的试剂用于制备对肝细胞肝癌进行 疾病进展动态监测、疗效评价、预后评估或肝癌肝移植循环肿瘤细胞本底检测的产品(例如 试剂盒）的用途，所述细胞表面标志分子选自CK8、CK18、CK19、GPC3、ASGPR1、ASGPR2中的 至少一种。
[0011] 本发明第四方面涉及产品（例如试剂盒）或组合物，其包含检测细胞表面标志分子 的试剂，所述细胞表面标志分子选自CK8、CK18、CK19、GPC3、ASGPR1、ASGPR2中的至少一种； 所述产品(例如试剂盒）或组合物用于检测肝细胞肝癌循环肿瘤细胞、诊断或辅助诊断肝细 胞肝癌、或者对肝细胞肝癌进行疾病进展动态监测、疗效评价、预后评估或肝癌肝移植循环 肿瘤细胞本底的检测。
[0012] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述的细胞表面标志 分子包括（1)〇(8、0(18、0(19中的至少一种，（2)456?1?1和/或456?1?2，以及（3)6?〇3。
[0013] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述的检测细胞表面 标志分子的试剂是指能够特异性识别细胞表面标志分子的抗体，例如单克隆抗体或多克隆 抗体，优选单克隆抗体。
[0014] 在本发明的实施方案中，所述检测细胞表面标志分子的抗体是指分别能够与 CK8/18/19、GPC3、ASGPR1/2特异性结合的单克隆抗体。
[0015] 在本发明的具体实施方案中，所述检测CK8、CK18、CK19的抗体为一种共同抗 体，其能够分别与CK8、CK18或CK19特异性结合。在本发明的具体实施方案中，所述检测 ASGPRUASGPR2的抗体为一种共同抗体，其能够分别与ASGPRl或ASGPR2特异性结合。
[0016] 在本发明的实施方案中，所述抗GPC3抗体购自Santa Cruz公司（USA)，其Cat. 勵.为8(：-11395，其1^^.勵.为83738。
[0017] 在本发明的实施方案中，所述抗ASGPR1/2抗体购自Sigma-Aldrich公司（USA)，其 〇&七勵.为即六011954，其1^〇七勵.为六37306。
[0018] 在本发明的实施方案中，所述抗CK8/18/19抗体购自Miltenyi公司（Germany),其 Cat. NO.为 130-080-101，其 Lot. NO.为 5100630005。
[0019] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述的产品或组合物 中还包括检测细胞表面标志物CD45的试剂；优选地，所述检测CD45的试剂为抗CD45抗体， 更优选地，所述抗体为单克隆抗体。
[0020] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述的抗体还连接有 可检测的标记或者易于分离的物质。
[0021] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述的产品或组合物 中还包括第二抗体，所述第二抗体能够特异性识别检测细胞表面标志分子的抗体；优选地， 所述第二抗体还连接有可检测的标记或者易于分离的物质。
[0022] 在本发明中，所述可检测的标记为本领域公知，例如为链霉亲和素标记、荧光标 记、酶标记或同位素标记。在本发明的实施方案中，所述可检测的标记是指荧光标记。
[0023] 在本发明中，所述易于分离的物质为本领域所公知，例如为磁珠。
[0024] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述的产品或组合物 中还包括用于富集血液中有核细胞的试剂。
[0025] 根据本发明以上各方面任一项的用途或产品或组合物，其中所述用于富集有核细 胞的试剂包括红细胞裂解液、白细胞结合剂、核染色剂中的至少一种。
[0026] 在本发明中，可以选用本领域公知的红细胞裂解方法来裂解并去除红细胞。在 本发明的实施方案中，所述红细胞裂解液的成分为：155mmolNH 4CL，10mmolKHC03,0.1 mmol EDTA。
[0027] 在本发明中，可以选用本领域公知的方法去除血液中的白细胞。在本发明的实施 方案中，所述白细胞结合剂为偶联CD45抗体的磁珠(例如纳米磁珠)，该磁珠能够与白细胞 表面的CD45蛋白结合，因此可进一步用磁力分离器分离并去除白细胞。
[0028] 在本发明中，可选用本领域公知的方法对细胞核进行染色。在本发明的实施方案 中，所述核染色剂为DAPI。
[0029] 在本发明中，所述产品为试剂盒或者检测设备；当产品为试剂盒时，所述试剂盒中 包括检测细胞表面标志分子的试剂，所述细胞表面标志分子选自CK8、CK18、CK19、GPC3、 ASGPRl、ASGPR2中的至少一种，优选为包括（1)CK8、CK18、CK19中的至少一种，（2) ASGPRl 和/或ASGPR2,以及（3) GPC3 ;当产品为检测设备时，所述检测设备通过检测细胞表面标志 分子来检测肝细胞肝癌循环肿瘤细胞、诊断或辅助诊断肝细胞肝癌、或者对肝细胞肝癌进 行病情动态监控、疾病复发监测、疗效评价、预后评估或肝癌肝移植循环肿瘤细胞本底的检 测，所述细胞表面标志分子选自CK8、CK18、CK19、GPC3、ASGPRl、ASGPR2中的至少一种，优选 为包括（I) CK8、CK18、CK19 中的至少一种，（2) ASGPRl 和 / 或 ASGPR2,以及（3)GPC3。
[0030] 在本发明中，用于检测的样本为外周血，例如为外周静脉血液，特别是全血，或者 为全血中的有核细胞成分。
[0031] 在本发明中，用于检测的外周血的体积为5-10ml。在本发明的实施方案中，所述外 周静脉血的体积为7. 5ml。