一种急症腹痛早期筛查的蛋白芯片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明急症腹痛早期筛查的蛋白芯片涉及一种蛋白质芯片，蛋白质芯片技术是将 蛋白或多肽有序地点阵在固体基片上，利用免疫学方法对蛋白质进行检测、识别、鉴定的新 兴技术。
【背景技术】
[0002] 急症腹痛（acute abdominal pain)是急诊患者最常见的病症之一。其就诊全年均 可出现，高峰分别是秋季（9~11月）和夏季（6~8月），就诊年龄集中在15~44岁之间 (占就诊总数的72. 7%)。常涉及内、外、儿、妇产甚至神经、精神各科的疾病。其主要病因 是腹腔内脏器官发生病变、结构机能失常、腹外邻近器官损伤和/或全身性疾病所致。据统 计，非创伤性急症腹痛疾病中急性胰腺炎的发病率最高，其次是急性胃肠炎、急性肠梗阻、 急性阑尾炎、急性胆管炎、溃疡急性穿孔等。该类疾病往往具有发病急、变化快、病情复杂且 严重等特点，加之，目前医院急诊科临床医生趋于年轻化，在急诊诊断方面经验不足，容易 诊断有误或治疗欠妥，这样可能造成不良后果，甚至死亡。因此，对急症腹痛的诊断要求较 高，能否及时做出明确的诊断，进行合理的治疗，将直接影响着疾病的治疗与预后。针对此 现象，本发明研制出通过联合检测血清中胰蛋白酶原_2(TPS II )、血清淀粉样蛋白A(SSA)、 超敏C反应蛋白（hs-CRP)、降钙素原（PCT)与抵抗素进行急症腹痛疾病早期筛查的蛋白芯 片，对急症腹痛常见的急性胰腺炎、急性阑尾炎、急性腹膜炎、急性胃肠炎与溃疡性急性穿 孔进行排除。
[0003] 目前，国外在临床急症腹痛的检测方面，主要通过结合患者病史，进行体格检查、 实验室辅助检查，根据患者病情选择性地进行血糖、妊娠试验、血电解质、肝肾功能、腹部CT 检查、腹腔诊断性穿刺以及腹水分析等检查分析，然后综合考虑，提出相应的治疗方案。此 外，还采用对急症腹痛患者尿胰蛋白酶原-2的检测，进行急性胰腺炎的排查，但对于急症 腹痛相关的其他疾病的排查尚没有相关生物标记物的报道。在国内，对于急症腹痛的临床 检测与国外临床检测相似，但TPS II在国外临床诊断中的应用开展较早，而在国内是近两 年陆续才开始在三级甲等医院走入临床应用，它的临床应用价值依旧处于进一步的探索 中。本发明利用蛋白芯片对急症腹痛患者血清中TPS II、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素进行联 合检测，对急症腹痛常见疾病进行排查，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助工具。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种急症腹痛早期筛 查的蛋白质芯片，该蛋白质芯片可以同时测定血浆中胰蛋白酶原-2 (TPSII)、超敏C反应蛋 白（hs-CRP)、血清淀粉样蛋白A(SSA)、降钙素原（PCT)及抵抗素（resistin)的含量，从而 通过一次检测，既可实现对急症腹痛的相关疾病进行排查的灵敏度高、精确性好并且方便 快速的蛋白芯片检测技术，帮助临床医生对急症腹痛相关疾病做出及时诊断，也为病情评 估或预后判断进行辅助判断。
[0005] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种用于急症腹痛早期筛查的蛋 白质芯片，包括基片和阵列式分布于所述基片上的目标蛋白检测指标和对照检测指标涂 层，所述目标蛋白检测指标涂层由目标蛋白抗体点样到所述基片上得到，所述目标蛋白抗 体包括胰蛋白酶原-2抗体、超敏C反应蛋白抗体、血清淀粉样蛋白A抗体、降钙素原抗体及 抵抗素抗体，所述对照检测指标涂层包括样品对照标志物、阳性对照标志物、阴性对照标志 物和试剂对照标志物，其中，所述的样品对照标志物为人血清抗原；阳性对照标志物为在正 常人血清中分别添加中添加胰蛋白酶原-2、超敏C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、降钙素原 及抵抗素标准品制得，所述的阴性对照标志物为正常人血清。其中正常人血清TPS II的含 量低于50 μ g/L，SSA的含量低于0· 5ng/mL，hs-CRP含量低于3mg/L，PCT的含量低于0· 5ng/ mL，抵抗素的含量低于14ng/mL。
[0006] 优选地，所述的阳性标志物中，胰蛋白酶原_2、超敏C反应蛋白、血清淀粉样蛋白 A、降钙素原及抵抗素的添加量为正常血清中胰蛋白酶原-2、超敏C反应蛋白、血清淀粉样 蛋白A、降钙素原及抵抗素含量的临界值的3倍。其中，正常血清中TPS II、SSA、hs-CRP、PCT 与抵抗素含量的临界值分别为50 μ g/L，0. 5ng/mL，3mg/L，0. 5ng/mL，14ng/mL。
[0007] 优选地，所述的基片为玻璃基片或塑料基片，所述蛋白检测指标和对照检测指标 分别在所述基片上进行多次重复点样形成阵列式点样涂层，每个阵列重复多次，优选地，上 述重复次数为6~8次。
[0008] 本发明进一步提出了上述急症腹痛早期筛查的蛋白质芯片的制备方法，包括如下 步骤：
[0009] (1)准备玻璃基片或塑料基片，上述玻璃基片或塑料基片上自带有醛基；
[0010] (2)确定点阵的排列方式和点样位置，将胰蛋白酶原-2、超敏C反应蛋白、血清淀 粉样蛋白A、降钙素原和抵抗素与样品对照标志物、阳性对照标志物、阴性对照标志物和试 剂对照标志物同时点阵与同一张基片的不同位置，构成阵列式点样涂层，每个阵列重复若 干次；
[0011] (3)根据样品数量设计阵列排布，使用高速全自动点样机器人将目标抗体以及样 品对照标志物抗体、阳性对照标志物的抗体和阴性对照标志物的抗体点阵于基片上，使得 上述目标抗体通过化学键固定在基片上，室温放置16小时以上，并置于4°C保存，其中，所 述目标抗体包括胰蛋白酶原-2抗体、超敏C反应蛋白抗体、血清淀粉样蛋白A抗体、抗降钙 素原抗体和抗抵抗素抗体；
[0012] (4)最后，利用制作蛋白芯片的常规方法进行封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
[0013] 本发明更进一步地提出了所述的蛋白质芯片在急症腹痛早期筛查中应用。
[0014] 具体地，在应用中按照如下步骤进行：
[0015] (1)将待检测血清滴加于所述蛋白质芯片表面，37°C孵育1~1. 5小时；
[0016] (2)待检测血清中的胰蛋白酶原-2、超敏C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、降钙素原 和抵抗素将分别与固定在蛋白质芯片上的相应抗体结合，用低浓度钠盐洗去多余样品；
[0017] (3)加封闭液进行封闭，再次洗脱并晾干；
[0018] (4)加入封闭液稀释过的荧光标记的抗胰蛋白酶原-2抗体、抗超敏C反应蛋白抗 体、抗血清淀粉样蛋白A抗体、抗降钙素原抗体及抗抵抗素抗体的混合物，37°C孵育半小时 后洗去未结合物并晾干；
[0019] (5)反应结束后，利用芯片扫描分析仪进行结果的判读，其中，样品点的荧光强度 与血清中的胰蛋白酶原-2、超敏C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、降钙素原及抵抗素的含量 成正比。
[0020] 优选地，步骤（2)中，所述的低浓度钠盐的浓度为0. 6wt%~0. 9wt%。
[0021 ] 优选地，步骤（3)中，所述的洗脱液为ρΗ6· 0的PBS缓冲液。
[0022] 本发明提出了一种可以同时测定血浆中TPS II、SSA、hs_CRP、PCT和抵抗素的蛋白 芯片，所述蛋白芯片由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标涂层及对照检测指标涂 层组成。其中，蛋白检测指标涂层包括胰蛋白酶原_2(TPS II )、超敏C反应蛋白（hs-CRP)、 血清淀粉样蛋白A(SSA)、降钙素原（PCT)及抵抗素（resistin)，对照检测指标涂层包括样 品对照标志物、阳性对照标志物、阴性对照标志物、试剂对照标志物。通过物理固定方法将 各个检测指标固定于涂层上，即在涂布游偶氮聚合物的玻璃基片上点样抗原等蛋白质。用 光线照射后，偶氮聚合物产生順式异构体-反式异构体的交替变换，蛋白质逐渐陷入偶氮 聚合物内部。停止光照后，偶氮聚合物重新凝固成固体，蛋白质就实现了在基片上面的物理 固定，基片是玻璃基片。将TPS II、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素生物标志物，与样品对照、阳 性对照、阴性对照和试剂对照构成阵列式点样涂层，同时点阵于一张基片上，每个阵列重复 16组，该组数可以根据具体的需求进行放大或缩小。
[0023] 上述芯片涂层上的每个阵列中每个蛋白检测指标有3个重复点，对照指标也有3 个重复点。阵列的多少和大小与所检测的蛋白标志物的多少、基片大小以及点样的大小直 接有关，其中与被检测的标记物的数量及基片的大小呈正相关，与点样的大小呈负相关。
[0024] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0025] (1)灵敏度高、检测方便、耗时短，且能同时检测多种急症腹痛相关的生物标记物， 节约了样本的消耗量，同时也节省了人力、物力与财力；
[0026] (2)所述的标志物抗体均为单克隆抗体，所述单克隆抗体均通过单克隆杂交瘤细 胞技术制备得到或者通过噬菌体抗体技术筛选得到；
[0027] (3)通过血清TPS II与hs-CRP的联合检测，对急性胰腺炎急性排查；
[0028] (4)通过联合检测血清中PCT与hs-CRP的含量，及时、有效地完成急性腹膜炎的诊 断排查，有助于临床疗效的观察；
[0029] (5)通过血清SSA与hs-CRP的联合检测，对急性阑尾炎进行排查；
[0030] (6)通过对患者血清中抵抗素与hs-CRP的含量的检测，对溃疡性急性穿孔进性排 查；此外，血清hs-CRP的水平对急性胃肠炎、急性胆管炎及急性肠梗阻等炎症疾病的早期 诊断也存在有效价值。
【附图说明】
[0031] 图1急症腹痛早期筛查蛋白芯片的检测原理示意图。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1 一种急症腹痛早期筛查的蛋白芯片的制备。
[0033] 其步骤主要是：（1)准备玻璃基片或者塑料基片，上述玻璃基片或塑料基片上自 带有醛基；（2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置，将TPS II、SSA、h