抱子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括W下步骤：
[0033] 1、鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株1G5、2D9的建立；
[0034] 2、家蚕微抱子虫胞壁蛋白1G5、2D9单克隆抗体的腹水制备及纯化；
[0035] 3、家蚕微抱子虫A1地aLISA的检测；
[0036] 4、AlphaLISA检测方法的评价。
[0037] 二、具体步骤包括：
[0038] 1、鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立；
[0039] 1. 1家蚕微抱子虫抱壁蛋白抗原的制备：
[0040] 基于"尽可能保留抗原蛋白的天然空间构象"的原则，采用"两步破碎法"制备家 蚕微抱子虫的"抱壳碎片"；
[0041] 将微抱子虫的抱子和发芽抱子用玻璃珠破碎12小时后，进行DAPI染色观察并进 行筛选，得到的较纯的抱壳，视野里没有看到发出藍光的抱子核，通过观察多个视野统计， 所制备抱壳的纯度为99%W上，用于进一步破碎制备抱壳碎片；将上述一次破碎后的抱壳 进行第二次破碎，并将所制备的"破碎抱子总蛋白"、"破碎抱壳碎片"、"发芽抱子总蛋白" 和"发芽抱壳碎片"进行SDS-PAGE检测，结果如图1 ;图1中M泳道为Marker;1 ;发芽抱子 总蛋白；2;破碎抱子总蛋白；3;抱子悬液被破碎4小时后的上清；4;抱子悬液被破碎2小 时后的上清；5 ;发芽抱壳碎片；6 ;破碎抱壳碎片。从图1可W得出；两种抱壳碎片体系在 25-35邸a之间有S条明显的条带，在25邸aW下也有条带，而且该些条带都包含在总蛋白 的条带中，说明所制备的抱壳碎片条带比较丰富。
[0042] 1. 2鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立：
[0043] 将1. 1制备的家蚕微抱子虫破碎抱壳碎片蛋白免疫BALB/C小鼠（所述家蚕微抱 子虫抱壳碎片蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示），采用PEG1500细胞融合技术，制备 单克隆抗体，结果显示一次融合共分装384孔（分为4板96孔板来分装384个样品），融合 成功370孔，融合率达96. 3%，ELISA初检阳性率达17. 3%;选择阳性值较高的38个孔亚 克隆，经过2次亚克隆，不断反复筛选，最终得到了 2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命 名为1G5、2D9。细胞融合的筛选结果如表1、图2所示；表1中显示了 4个96孔板中融合孔 数，ELISA阳性孔数和化ISA阳性率。图2表明鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体进 行细胞融合后第8天生长状态良好。
[0044] 表1细胞融合及阳性率一览表
[0045]
【主权项】
1. 一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括如下步骤： 1) 家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原的制备：先将微孢子虫的孢子用玻璃珠破碎12~13小时 后，进行DAPI染色观察，并进行筛选，视野里没有看到发出蓝光的孢子核，通过观察多个视 野统计，所制备孢壳的纯度为99%以上，得到微孢子虫孢壳；然后，将所述微孢子虫孢壳再 用玻璃珠破碎12~13小时，得到孢壳碎片蛋白，即家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原； 2) 鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立：以步骤1)制得的孢 壳碎片蛋白为抗原，免疫BALB/C小鼠，采用PEG1500细胞融合技术，并经过亚克隆筛选，得 到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 3) 家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的腹水制备及纯化：复苏步骤2)制得的家蚕微 孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，培养至对数生长期时，腹腔注射BALB/C小鼠，收 集腹水，并采用辛酸-硫酸铵法进行抗体的纯化；将纯化的家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆 抗体分为两份，一份用生物素标记，另一份与受体微球偶联； 4) 家蚕微孢子虫AlphaLISA检测方法的建立：采用双抗体夹心法检测微孢子虫； ① 家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体与生物素连接：取步骤3)制备的纯化抗体1 mg加入带有滤膜的离心管中，以9000 r/min离心8 min;用标记缓冲液（0. lmol/L Na2CO3/ NaHCO3, pH9. 5)重复洗涤6次；收集抗体，配制成50 y L的抗体溶液，所述抗体溶液中包括 家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体、标记缓冲液和5 yL 22 mg / mL的生物素(用DMSO配 制）;将所述抗体溶液于室温振动孵育4 h，利用带有滤膜的离心管去除多余生物素，得到生 物素化抗体，并将生物素化抗体用IxAphaLISA缓冲溶液调整浓度为0. 5 mg/mL ; ② 家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体与受体微球偶联：取步骤3)制备的纯化抗体 0.2 mg加入带有滤膜的离心管中，以9 000 r/min离心8 min，用缓冲液（0.13 mol/L，pH 8.0 PBS)重复洗涤6次后收集抗体，在抗体溶液中加入I mg受体微球、10 y L 25 mg/mL NaBH3CN (用PBS缓冲液配制，现配现用）、1. 25 y L质量浓度为10%的Tween-20,而后用缓 冲液将总体积补充到200 yL，于37 °C避光振荡反应48 h;最后加入10 yL 65 mg/mL羧 甲基羟胺盐酸盐溶液(用0.8 mol/L NaOH配制，现配现用），于37 °C避光孵育I h封闭未 结合位点，离心洗涤，得到已连接抗体的受体微球，用IxAphaLISA缓冲液调整受体微球浓 度为 5 mg/mL ; ③ 方法的建立：将步骤②制得的已连接抗体的受体微球与IxAphaLISA缓冲液按照 1:50~1:100的体积比进行稀释，步骤①制得的生物素化抗体与IxAphaLISA缓冲液按照 1:200~1:400的体积比进行稀释；在微孔板中分别加入标准品或待检测样品、连接抗体的 受体微球和生物素化抗体各25 y L，于37°C振动孵育20 min，然后避光条件下加入链霉亲 和素化的供体微球175 yL，于37°C振动孵育20 min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上检 测信号值。
2. 如权利要求1所述家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，其特征在 于，所述步骤③方法的建立具体步骤包括： (1) 将所述已连接抗体的受体微球与IxAphaLISA缓冲液按照1:50~1:100的体积比进 行稀释，作为试剂1 ; (2) 将所述生物素化抗体与IxAphaLISA缓冲液按照1:200~1:400的体积比进行稀释， 作为试剂2 ; (3) 将 IOXAlphaLISA assay Buffer 用超纯水稀释成 IXAlphaLISA assay Buffer， 将所述链霉亲和素化的供体微球用IXAlphaLISA assay Buffer稀释至终浓度为40 yg/ mL，作为试剂3 ; (4) 将家蚕蚕卵用PBS缓冲液（0.0 lmol/L，pH7. 4)研磨后，用纱布过滤，取滤液于 500~600 r/min离心2~3 min，收集上清液，并将上清液再于3000~3500 r/min离心10~11 min，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液（0.0 lmol/L，pH7. 4)稀释到5mL，作为蚕卵研磨液； (5) 向步骤（4)制备的蚕卵研磨液中加入家蚕微孢子虫，使家蚕微孢子虫在蚕卵研 磨液中的浓度依次为 IO7 spores/mL、106 spores/mL、105 spores/mL、104spores/mL 和 103spores/mL； (6) 标准曲线的建立：取步骤（5)各浓度含有家蚕微孢子虫的蚕卵研磨液、步骤（1)制 备的试剂1和步骤（2)制备的试剂2各25 y L，混合均匀，组成标准品实验组；取步骤（4)制 备的蚕卵研磨液、步骤（1)制备的试剂1和步骤（2)制备的试剂2各25 yL，混合均匀，作为 阴性对照；将所述标准品实验组和阴性对照的样品均于37°C振动孵育20 min，然后于避光 条件下加入175 y L步骤（3)制备的试剂3,再于37°C振动孵育20 min后，在AlphaScreen/ Lisa检测仪上615 nm处，检测标准品实验组的各信号值；以标准品组各浓度的对数值为横 坐标，各浓度标准品的信号值与阴性对照的信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线； (7) 待测样品的检测：待测样品采用与步骤（4)相同的方法进行处理，得到待测样品研 磨液；取待测样品研磨液、步骤（1)制备的试剂1和步骤（2)制备的试剂2各25 yL，混合 均匀，于37°C振动孵育20 min，然后于避光条件下加入175 y L步骤3)制备的试剂3,再于 37°C振动孵育20 min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615 nm处，检测待测样品的信号 值，并根据步骤（6)建立的标准曲线，进行计算，得到待测样品研磨液中微孢子虫的浓度，进 而检测出家蚕蚕卵中的微孢子虫含量。
3.如权利要求1或2所述家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，其特征 在于，所述受体微球和供体微球均为纳米级微粒；所述受体微球表面包被有化学发光剂和 镧系元素铕；所述供体微球表面包被有链酶亲和素和光敏剂。
【专利摘要】本发明提供一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原的制备，鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的腹水制备及纯化，以及家蚕微孢子虫AlphaLISA检测方法的建立。采用本发明方法进行检测时，在生物分子不存在特异的相互作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生，进而带来了更高的敏感性和精确性，检测结果更加精确，具有较高的均一性，且背景干扰少、背景低，具有广泛的动态检测范围；使用本发明试剂盒进行检测时样本需求量极少，且在检测过程中无需洗涤，简化了检测流程，具有良好的市场前景。
【IPC分类】G01N21-76, G01N33-569, G01N33-543, G01N33-577
【公开号】CN104865243
【申请号】CN201510325153
【发明人】吴胜昔, 潘国庆, 周泽扬, 李春峰, 吴海晶, 李曾, 蔡家利
【申请人】西南大学, 重庆理工大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月12日