一种检测猪早孕因子胶体金检测试纸卡及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物医学免疫检测、诊断领域，具体是涉及一种检测猪早孕因子的胶体金试纸卡及其制备方法。
【背景技术】
[0002]运用早期妊娠诊断方法对提高母猪繁殖效率和养猪业生产效益的十分有帮助，母猪配种后，如果能够尽早的进行妊娠确诊，就能够减少母猪的空怀期或非繁殖天数，增加母猪的平均年产仔窝数，同时有利于对繁殖障碍母猪的及早治疗处理。而现在普遍采用的早期妊娠诊断方法中有的诊断准确率不稳定、有的操作方法步骤繁琐、有的使用仪器昂贵、有的对操作人员经验要求高，在众多检测方法中快速试纸检测能够具备操作简单、灵敏性高、特异性好、价格低廉等诸多优点而具备推广应用价值。
【发明内容】
[0003]本发明的主要目的在于提供一种猪早孕因子胶体金检测试纸卡，快速检测母猪早孕因子，用于母猪早期妊娠的临床诊断。本发明创新点在于利用基因克隆技术，人工合成具有天然早孕因子活性的猪早孕因子蛋白，在此基础上得到敏感性高、特性好的鼠源猪早孕因子单克隆抗体，经过试纸卡组装得到猪早孕因子胶体金检测试纸卡。
[0004]本发明所采用的技术方案是:
[0005]1、猪早孕因子胶体金检测试纸卡，其特征在于:
[0006]所述的猪早孕因子胶体金检测试纸卡由胶体金试纸条和扣板式卡槽组成；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(硝酸纤维素膜)、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成；
[0007]所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；
[0008]所述NC膜的中部有一条含有猪早孕因子多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；
[0009]胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫；
[0010]所述载样垫中金标单克隆抗体为鼠源猪早孕因子单克隆抗体；所述NC膜中猪早孕因子抗体为兔抗猪早孕因子多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
[0011]2、上述的猪早孕因子胶体金检测试纸卡的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0012](I)制备 NC 膜
[0013]兔抗猪早孕因子多克隆抗体的制备:采用原核表达并纯化的猪早孕因子蛋白作为免疫原，提取IgG抗体，制备多克隆抗体；
[0014]检测线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?50dotS/mL/Cm，用包被缓冲液稀释兔抗猪早孕因子多克隆抗体，浓度为45?50 μ g/mL，在NC膜中适当位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.40?0.45 μ L滤膜过滤的0.05?0.07Μ、ρΗ9.6的CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液);
[0015]质控线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?48dotS/ml/cm，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，浓度为lmg/ml，在NC膜上与检测线平行的位置划线，与检测线间隔4?5mm，即为质控线；
[0016]NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜；用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为含质量百分比的
2.5% BSA,2.5?3.0%脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后用0.45?0.48ul滤膜过滤得到的封闭工作液。
[0017](2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
[0018]用20mM含质量百分比为1.5% BSA,0.1% NaNjP 3%四硼酸钠稀释缓冲液(水溶液)将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml ;裁取规格为300 X 7_的玻璃纤维棉，将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪，以5 μ L/cm的速度(大约20ng/条)，均匀喷洒于玻璃纤维棉上，56°C干燥lh，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0019](3)组装猪早孕因子胶体金检测试纸卡
[0020]将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维膜和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中即为猪早孕因子胶体金检测试纸卡。
[0021](4)猪早孕因子胶体金检测试纸卡使用及判定
[0022]猪早孕因子胶体金检测试纸卡在诊断猪早期妊娠中应用，分离血清，将所得的血清滴加在本试纸卡的样品垫中，样品顺吸水垫上移，当遇到金标单克隆抗体时猪早孕因子与金标鼠抗猪早孕因子单克隆抗体结合，抗原-抗体-金复合物向检测线和质控线移动，猪早孕因子与检测线上的兔抗猪早孕因子多克隆抗体结合，形成一条红色的检测线，阴性血清中无猪早孕因子不能结合金标鼠抗猪早孕因子单克隆抗体，所以无肉眼可见的检测线出现；质控线永远呈红色，如果无色的，表示试纸条失效。
[0023]进一步地，步骤(I)中检测线和质控线的线宽为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6?7_。
[0024]有益效果:
[0025]本发明所述的胶体金试纸卡利用最新抗原表位筛选技术，人工合成具有天然早孕因子活性的猪早孕因子蛋白，在此基础上得到敏感性高、特性好的猪早孕因子单克隆抗体。然后根据现代国际最先进的胶体金免疫层析技术，优化试纸卡组装条件，通过试纸卡中NC膜上分别喷涂含兔抗猪早孕因子多克隆抗体的检测线和含羊抗鼠IgG抗体的质控线，能够临床检测猪早孕因子，为养猪企业提供一种临床诊断母猪早期妊娠的试纸卡。该试纸卡具有特异性强、灵敏度高、检测方便快速的优点，在整个检测过程中不需要使用专业仪器设备，多操作人员要求低，而且试纸卡成本低廉，操作方便，能广泛应用于猪早期妊娠的诊断，为了解母猪孕情和对母猪假孕进行诊断奠定了基础。
【附图说明】
[0026]图1是本发明的胶体金试纸卡的结构示意图；
[0027]图中:1、扣板式卡槽2、支持板，3、加样孔4、样品垫5、金标抗体垫6、NC膜7、观察区8、吸收垫
【具体实施方式】
[0028]实施例1
[0029]猪早孕因子胶体金检测试纸卡由胶体金试纸条和扣板式卡槽组成；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成；所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；所述NC膜的中部有一条含有猪早孕因子多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫；所述载样垫中金标单克隆抗体为鼠源猪早孕因子单克隆抗体；所述NC膜中猪早孕因子抗体为兔抗猪早孕因子多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
[0030]实施例2
[0031]猪早孕因子胶体金检测试纸卡的制备方法，包括以下步骤:
[0032](I)制备 NC 膜
[0033]兔抗猪早孕因子多克隆抗体的制备:采用原核表达并纯化的猪早孕因子蛋白作为免疫原，提取IgG抗体，制备多克隆抗体；
[0034]检测线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?50dotS/mL/Cm，用包被缓冲液稀释兔抗猪早孕因子多克隆抗体，浓度为45?50 μ g/mL，在NC膜中适当位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.40?0.45 μ L滤膜过滤的0.05?0.07Μ、ρΗ9.6的CBS缓冲液；
[0035]质控线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?48dotS/ml/cm，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，浓度为lmg/ml，在NC膜上与检测线平行的位置划线，与检测线间隔4?5mm，即为质控线；
[0036]NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜；用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为含质量百分比的
2.5% BSA,2.5?3.0%脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后用0.45?0.48ul滤膜过滤得到的封闭工作液。
[0037](2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
[0038]用20mM含质量百分比为1.5% BSA,0.1% NaNjP 3%四硼酸钠稀释缓冲液将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml ;裁取规格为300X 7mm的玻璃纤维棉，将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪，以5 μ L/cm的速度(大约20ng/条)，均匀喷洒于玻璃纤维棉上，56°C干燥lh，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0039](3)组装猪早孕因子胶体金检测试纸卡
[0040]将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维膜和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中即为猪早孕因子胶体金检测试纸卡。
[0041](4)猪早孕因子胶体金检测试纸卡使用及判定
[0042]猪早孕因子胶体金检测试纸卡在诊断猪早期妊娠中应用，分离血清，将所得的血清滴加在本试纸卡的样品垫中，样品顺吸水垫上移，当遇到金标单克隆抗体时猪早孕因子与金标鼠抗猪早孕因子单克隆抗体结合，抗原-抗体-金复合物向检测线和质控线移动，猪早孕因子与检测线上的兔抗猪早孕因子多克隆抗体结合，形成一条红色的检测线，阴性血清中无猪早孕因子不能结合金标鼠抗猪早孕因子单克隆抗体，所以无肉眼可见的检测线出现；质控线永远呈红色，如果无色的，表示试纸条失效。
[0043]其中，步骤(I)中检测线和质控线的线宽为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6?7_。
[0044]实施例3
[0045]I制备鼠抗猪早孕因子单克隆抗体、兔抗猪早孕因子多克隆抗体
[0046]1.1鼠抗猪早孕因子基因单克隆抗体的制备
[0047]根据GenBank中猪EPF(猪早孕因子)基因核苷酸序列以及国际最新研宄EPF的空间构象及表位预测，利用Primer Premier 5.0软件设计出EPF上游引物5’ -CGGGATCCATGGCAGGACAAGCTTTTAG-3’下游引物 5’ -CCG CTCGAGGGATCCTCTTGGAACCAAGTCGACGTACTTTCCAAGA-3’。以猪骨骼肌卫星细胞为材料，利用经典TRIzol法提取总RNA，RT-PCR获得DNA。利用设计好引物PCR方法得到大小为341bp的EPF基因片段。获得基因片段送去上海生工测序结果显示与猪EPF同源性为99.9%未发生变异。
[0048]1.2 PET-28 a -EPF/BL21表达载体的构建及蛋白表达
[0049]以PMD-19T-EPF为底物进行PCR扩增目的片段，胶回收后Xh