基于暗场成像的固态纳米通道的光电同步传感方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及电化学分析技术及纳米光谱技术领域，具体地说，涉及利用等离子共振散射结合离子电流检测技术实现纳米通道光电信号同步传感的方法。
【背景技术】
[0002]纳米通道电化学检测技术(Nanopore Technique)是一种单分子分析技术，它利用生物分子自组装或通过半导体微加工手段，获得孔径从I纳米至数百纳米的纳米孔，然后利用电场驱动单个分子、纳米颗粒、聚合物等待测物穿过纳米尺寸的通道，从而引起纳米通道产生微弱的信号变化，在单分子、单颗粒水平上研宄待测物组成、运动等性质，实现对单个分子实时、高通量、无标记、超灵敏的分析。纳米通道电化学检测技术的主要应用领域包括:单分子DNA测序、致病蛋白及多肽的检测、生物分子相互作用过程的研宄以及单个纳米颗粒的分析等等。
[0003]固体纳米通道技术一般是利用微加工技术在固态薄膜上获得纳米孔，然后通过纳米孔连通电化学池及其内部的电解质溶液，在两个电化学池内施加一定电位后产生从皮安到纳安水平的离子电流；当单个待测物通过纳米通道时，由于单个待测物体积的排阻效应及自身待定的情况，造成从皮安到纳安水平的电流阻断或信号增强。
[0004]为了实现固体纳米通道技术可多通道同步读取，以及同步获取待测物分子结构、光学性质等信息，人们研宄出了利用荧光标记进行纳米通道光信号读取的方法，例如，利用过纳米孔过程单个待测物发出的微弱荧光信号的改变，对单个分子的行为、结构等进行分析。目前，用于纳米通道光电同步读取的技术是需要引入染料基团的，而这样做不仅会对单个分子、单个颗粒水平的待测物的运动行为产生影响，而且标记过程繁杂，染料分子光漂白、标记的失败都会影响单分子的分析结果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述不足，提供一种基于暗场成像的固态纳米通道的光电同步传感方法，通过金属镀膜的固态纳米通道芯片，利用可见光在纳米通道边缘激发局域表面等离子激元产生有特征的散射信号并被显微成像及光信号监测系统收集和记录，从而在不引入染料分子、无需标记的情况下，实现纳米通道中光电信号的同步传感。本发明的传感方法能对单分子、单颗粒水平实现对多种生物大分子(包括核糖核酸、脱氧核糖核酸、多肽、蛋白)、无机聚合物、金属或非金属纳米颗粒的运动行为、光学信息、结构性质信息进行实时高速读取。
[0006]为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
[0007]一种基于暗场成像的固态纳米通道的光电同步传感方法，其特征在于，包括以下步骤:
(O制备涂敷有金属纳米涂层的半导体基片薄膜
①利用微加工技术，在硅框架上制备厚度为100 nm以下的纳米通道半导体基片薄膜； ②在所述半导体基片薄膜上均匀涂敷一层或多层金属纳米涂层，获得涂敷有金属纳米涂层的半导体基片薄膜；
(2)制备金属覆膜纳米通道芯片
利用半导体纳米加工技术，在步骤(I)获得的涂敷有金属纳米涂层的半导体基片薄膜上加工直径为纳米水平的通道，所述通道的尺寸根据实际待测物选取，获得金属覆膜纳米通道芯片；
(3)制备光电检测微池
将步骤(2)获得的金属覆膜纳米通道芯片固定密封在由两个池体构成的光电检测微池之间，使半导体基片薄膜上的纳米通道成为上下两个池体之间唯一的连接通道；在一端的光电检测微池中加注所需浓度的电解质溶液；
(4)利用金属覆膜纳米通道暗场成像
将步骤(3)封装好的光电检测微池放入暗场显微成像系统进行暗场成像，利用光强和光谱采集记录装置持续记录光散射强度和光谱数据，获得持续稳定的纳米通道特征散射信号对时间的基线数据；
(5)利用金属覆膜纳米通道记录离子电流强度
在步骤(3)封装好的光电检测微池上下两池体间施加直流电压，利用皮安级电流放大器和高速数据采集装置，持续记录离子电流强度数据，获得持续稳定的纳米通道离子电流信号对时间的基线数据；
(6)加入待测物进行光电同步检测
在步骤(3)封装好的光电检测微池中加入待测物，再在所述光电检测微池的上下两池体间施加直流电压，即用封装的金属覆膜纳米通道芯片进行暗场成像，记录光散射强度和光谱数据，再同步记录纳米通道离子电流和特征散射信号随时间的变化数据；
(7)多通道数据分析
将步骤(6)同步记录得到的光散射强度和光谱数据与离子电流强度随时间变化的数据以及纳米通道特征散射信号随时间变化的数据进行分析比对。
[0008]进一步，步骤(I)所述的半导体基片薄膜包括:低应力氮化娃薄膜、二氧化娃薄膜、三氧化二铝薄膜、硫化钼薄膜或石墨烯薄膜。
[0009]进一步，步骤(I)所述的金属纳米涂层包括金、银、铜或铝的、能产生表面等离子激元(SPP)的金属纳米涂层，所述金属纳米涂层的厚度根据待测物性质选取。
[0010]进一步，步骤(2)所述的纳米水平的通道为直径I微米以下的通孔。
[0011]进一步，步骤(3)所述光电检测微池为透明的上下两个池体，所述池体的材质为聚合物、石英、玻璃或者能满足透光、密封要求且不与待测物发生化学反应的其他材料。
[0012]进一步，步骤(3)所述的电解质溶液为硝酸钾、氯化钾、氯化钠或磷酸盐缓冲溶液。
[0013]进一步，步骤(6)所述的待测物包括:核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、多肽、蛋白、纳米颗粒或病毒。
[0014]进一步，步骤(5)和步骤(6)所述的直流电压的电压范围为-1OOOmV至+1000mV，其产生的离子电流强度为皮安水平到纳安水平。
[0015]进一步，在步骤(6)的同步测试与记录中，金属镀膜纳米通道能产生表面等离子激元共振；通过调节所述金属镀膜纳米通道的几何形貌(如尺寸、形状)、镀膜厚度、镀膜种类以及通道及周围基片的形貌，能实现对所述金属镀膜纳米通道特有的散射信号强度、光谱、偏振状态的调控。
[0016]进一步，在步骤(6)的同步测试与记录中，金属镀膜纳米通道能产生离子电流信号；通过调节所述金属镀膜纳米通道的几何形貌(如尺寸、形状)、镀膜厚度、镀膜种类，能实现对所述金属镀膜纳米通道特有的离子电流信号基线的调控。
[0017]本发明基于暗场成像的固态纳米通道的光电同步传感方法的积极效果是:
(I)利用金属镀膜纳米通道边沿金属在可见光激发下产生的表面等离子激元共振，使纳米通道自身产生可被探测、可被调节、有特征的散射光信号，达到无需染料基团、无需标记就能读取单个纳米通道光信号的目的。
[0018](2)通过光电同步传感的方法，在不引入染料基团、染料分子并且在无需标记的情况下能实现对单个纳米尺度待测物穿孔(纳米通道)过程的实时动态监测。
[0019](3)利用同步可对照的数据采集方法，实现对待测物体积、带电情况、光学性质、化学结构等动态信息的采集，能从多个维度观测单个待测物在运动过程中各类性质变化的情况。
[0020](4)将光学探测与电流检测方法相结合，实现了大规模多通道信号的同步获取，加速了纳米通道技术的检测速率，扩大了其应用领域。
【附图说明】
[0021]图1为本发明基于暗场成像的固态纳米通道的光电同步传感方法的流程框图。
[0022]图2为实施例1涂敷有金属纳米涂层的半导体基片薄膜的结构示意图。
[0023]图3为金属覆膜纳米通道芯片的结构示意图。
[0024]图4为光电检测微池的结构示意图。
[0025]图5为暗场成像、光谱及光路强度监测的原理框图。
[0026]图6为图5中第二相机的替代形式。
[0027]图中的标号分别为:
1、金层；2、钛层；3、氮化娃薄膜；
4、方窗；5、基片；6、通孔；
7、上盖玻片；8、上池体；9、金属覆膜纳米通道芯片；
10、下池体；11、下盖玻片；12、注放液管。
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图继续介绍本发明基于暗场成像的固态纳米通道的光电同步传感方法的【具体实施方式】。需要说明的是，本发明的实施不限于以下的实施方式。<