付之鲎试验的抗凝血酶iii用的前处理剂及前处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及付之使用了整试剂的内毒素等祀标物质的检测试验的抗凝血酶III 用的前处理剂和包含该处理剂的整试剂盒、W及使用了它们的抗凝血酶III的前处理方法 和使用了整试剂的内毒素等祀标物质的测定方法。
[0002] 本发明中，有时使用下述简称。
[0003] Et;内毒素
[0004] BG;(1 - ：3)-e-D-葡聚糖
[0005] ATIII;抗凝血酶III
【背景技术】
[0006] 内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且己知是强致热原。 此外，己知的是，除了发热W外，内毒素还会引起休克症状等各种病状。因此，从确保医药品 等的安全性的观点出发，注射剂等医药品、水、医疗器具等中的内毒素的检测、定量很重要。
[0007] 己知的是，若革兰氏阴性细菌感染整，则会引起血液凝固，该现象被用于内毒素的 检测。目P，可W使用整血细胞提取液（整的变形细胞溶解物，下文中也称为"LAL")测定内 毒素。该被称为整试验，利用存在于LAL中的各种蛋白质（均为丝氨酸蛋白酶）的级联反 应，该反应是通过内毒素与LAL接触而发生的。
[000引ATIII为血液中的抗凝血因子，被用于弥散性血管内凝血值1C)等的治疗。此处， 由于ATin为丝氨酸蛋白酶抑制剂，因此可抑制参与存在于LAL中的级联反应的蛋白质的 活性（非专利文献1)。该样，有时通过待测试样而显示出对于整试剂的抑制作用。该种抑 制作用有时可通过待测试样的稀释来避免（非专利文献2)。但是，ATIII对于整试剂的抑 制作用极强，为了将ATIII制剂（注射剂）付之整试验，需要稀释64倍W上（非专利文献 2)。由此，若考虑整试剂的检测灵敏度（校准曲线的最小内毒素浓度），则认为难W将整试 验适用于ATIII制剂（非专利文献2)。实际上，关于包含ATIII的试样，现在也利用兔发热 试验进行内毒素的检测（非专利文献1)。
[0009] 非专利文献1中公开了一种测定ATIII制剂的化的方法，其特征在于，将ATIII 制剂稀释100倍，在70°c加热20分钟进行前处理后，与LAL反应，通过光散射法进行测定。 该方法的技术特征在于，为了使Et的检测高灵敏度化，代替使用分光光度计的比浊法而采 用了使用光散射测定装置的光散射法。但是，该方法与上述同样地必须进行高倍率的稀释， 而且至少还存在W下的问题。
[0010] (1)作为整试验的测定装置而广泛普及的是分光光度计，为了实施光散射法而需 要另行新导入、使用光散射测定装置。
[0011] (2)在日本药典中，作为化的光学定量法仅规定了比浊法和比色法，未规定光散 射法。
[0012] 另外，在专利文献1中记载了下述生物体来源的试样的化及BG的测定方法，其特 征在于，使生物体来源的试样与碱±金属硫酸盐或碱±金属面化物接触，加热进行前处理 后，付之使用整试剂的测定。
[0013] 另外，在专利文献2中记载了下述血液来源的试样的化及BG的测定方法，其特征 在于，将生物体来源的试样与海地美锭化exadimet虹ine)化合物、碱金属氨氧化物、非离 子性表面活性剂及碱±金属面化物混合，加热进行前处理后，付之使用整试剂的测定。
[0014] 另外，在专利文献3中记载了下述有可能含有ATIII的试样的化测定方法，其特 征在于，使生物体来源的试样与固定有脂多糖和/或脂质A结合肤的载体接触，吸附回收Et 后，付之使用整试剂等的测定。
[0015] 但是，在所有文献中均未有关于下述内容的记载：为了实施ATIII的整试验，在与 二价金属盐共存的状态下，将ATIII供至使蛋白质失活的处理中，进行前处理。
[0016] 现有技术文献
[0017] 专利文献
[0018] 专利文献1 ;国际公开2006/080448号小册子
[0019] 专利文献2 ;日本特开平6-70796
[0020] 专利文献3 ;日本特开2010-243342
[0021] 非专利文献
[0022] 非专利文献1;内毒素?自然免疫研究15-飞跃的自然免疫研究一(工シFh丰 シシ?自然免疫研究15-飛躍子吝自然免疫研究一)、医学图书出版、P. 27~30、2012
[0023] 非专利文献2;内毒素研究12-自然免疫学的新展开一(工シFh丰シシ研究 12-自然免疫学①新t在展開一）、医学图书出版、P.93~97、2009
【发明内容】
[0024] 发巧要解决的间願
[0025] 本发明的课题在于提供一种手段，其可减少将ATIII付之整试验时的反应干扰作 用，因此可高精度地实施ATIII的整试验。此处所说的"反应干扰作用"是指，由于整试验 的测定对象物质巧t、BG等）W外的因素引起、并且对整试验的结果产生影响的所有作用。 因此，"反应干扰作用"例如包括;ATIII本身、与ATIII共存的添加物或杂质等成分、在前处 理时共存的前处理剂W外的试剂等成分、和/或整试剂中的成分等所引起的、该些成分自 身不溶化的作用、促进或抑制整试剂的反应的作用、改变Et的胶束结构或BG的高级结构而 使它们的活性（对于整试剂中的C因子或G因子的反应性）发生变化的作用等对整试验的 结果产生影响的所有作用。
[00%] 用于解决间願的方秦
[0027] 本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在与二价金属盐共存的 状态下，将ATIII付之热处理或酸处理等使蛋白质失活的处理中，由此能够降低将ATIII付 之整试验时的反应干扰作用，从而能够高精度地实施ATIII的整试验，由此完成了本发明。 [002引 即，本发明包括W下的方案。
[0029] 山
[0030] 一种前处理剂，其为付之整试验的抗凝血酶III用的前处理剂，
[0031] 该前处理剂含有二价金属盐，
[0032] 该前处理剂用于在将抗凝血酶III付之整试验前，在与上述前处理剂共存的状态 下，将该抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中。
[0033] [2]
[0034] 上述前处理剂，其中，上述二价金属盐为选自由二价金属氯化物、二价金属己酸盐 及二价金属硫酸盐组成的组中的一种或一种W上的金属盐。
[0035] [3]
[0036] 上述前处理剂，其中，构成上述二价金属盐的二价金属为选自由儀、巧、铺及锋组 成的组中的一种或一种W上的金属。
[0037] [4]
[003引上述前处理剂，其中，使抗凝血酶III与上述前处理剂共存时，来自上述二价金属 盐的二价金属离子的浓度为0. 5mMW上。
[0039]巧]
[0040] 上述前处理剂，其中，上述整试验的测定对象物质为内毒素。
[0041] [6]
[0042] 一种抗凝血酶III用的整试剂盒，其包含上述前处理剂。
[00 创[7]
[0044] 一种付之整试验的抗凝血酶III的前处理方法，其包括：在与上述前处理剂共存 的状态下，将抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中。
[0045][引
[0046] 上述前处理方法，其中，使上述蛋白质失活的处理为热处理或酸处理。
[0047] [9]
[0048] 上述前处理方法，其中，上述热处理在超过50°C的温度下进行。
[0049] [10]
[0化0] 上述前处理方法，其中，用于上述酸处理的酸为盐酸。
[0化1] [11]
[0化2] -种测定抗凝血酶III中的整试验的测定对象物质的方法，其包括；利用上述前 处理方法对抗凝血酶III进行前处理；W及将经前处理的抗凝血酶III付之整试验。
[0化3] [12]
[0化4]一种制造抗凝血酶III的方法，其包括；利用上述方法测定抗凝血酶III中的整试 验的测定对象物质。
【附图说明】
[0055] 图1是示出使用平行线定量法的试验的结果的图。
[0056] 图2是示出使用平行线定量法的试验的结果的图。
[0057] 图3是示出使用平行线定量法的试验的结果的图。
【具体实施方式】
[0化引 （1)本发明的前处理剂
[0化9] 本发明的前处理剂是含有二价金属盐的、付之整试验的ATIII用的前处理剂。本 发明的前处理剂用于在将ATIII付之整试验前，在与本发明的前处理剂共存的状态下，将 该ATIII供至使蛋白质失活的处理中。
[0060] 此处所说的"整试验"是指，利用整试剂检测（测定）祀标物质的试验。也将该祀 标物质称为"整试验的测定对象物质"。整试验的测定对象物质只要是能够通过整试验检测 的物质就没有特别限制，优选为化或BG、更优选为化。
[006U此处所说的"ATIII"只要是含有ATIII的试样就没有特别限制，可W为由ATIII构成的物质，也可W为包含ATIIIW外的成分的物质。对ATIII的形状也没有特别限制，例 如可W为液态，也可W为冷冻干燥物、粉末、颗粒、片剂等固态。
[006引作为ATIII，例如可W举出ATIII的注射用制剂。作为该种注射用制剂，具体来说 可W举出例如Neuart(注册商标；株式会社Benesis制）、Ansuronbin(财团法人化学及血 清疗法研究所制）、Nont虹on(注册商标；日本制药株式会社制）。在将该种ATIII的注射 用制剂付之本发明的前处理和整试验时，可W直接将原液用作待测物，也可W将浓缩后的 溶液用作待测物，还可W将用水或缓冲液等水性溶剂W任意倍率稀释而成的溶液用作待测 物。此处所说的"原液"是指，W通常将ATIII用作注射用制剂时的浓度50化it/mL的浓度 含有的溶液。"原液"例如如下得到；根据各ATIII的注射用制剂的所附文件中记载的方法， 将ATIII溶解于水性溶剂中，从而得到。此处所说的"浓缩后的溶液"是指，W超过50化it/ mL的浓度含有ATIII的溶液。作为"浓缩后的溶液"，例如可W举出在各ATIII的注射用制 剂的制造工序中得到的中间纯化物。
[0063] 另外，关于用水性溶剂稀释原液时的稀释倍率，只要能够检测整试验的测定对象 物质就没有特别限制，例如优选为超过1倍且小于64倍、更优选为超过1倍且为16倍W下、 进一步优选为超过1倍且为10倍W下、更进一步优选为超过1倍且为4倍W下、特别优选 为超过1倍且为2. 5倍W下、极其优选为1. 1倍W上且2. 5倍W下、特别极其优选为1. 2倍 W上且2. 5倍W下。需要说明的是，此处所说的"稀释倍率"是指，在本发明的前处理剂的共 存下进行使蛋白质失活的处理的反应液相对于所述"原液"的稀释的倍率。由此，稀释倍率 "1倍"是指，在本发明的前处理剂的共存下进行使蛋白质失活的处理的反应液中的ATIII 浓度与所述"原液"的ATIII浓度相同（原液原本的状态。不稀释原液，ATIIIW50化it/ mL的浓度存在）。
[0064] 另外，ATIII也可W为重组蛋白。重组ATII