循环肿瘤细胞检测探针及制备方法及应用诊断传感器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗检测技术领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞检测探针及其制备方法以及应用诊断传感器。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是威胁人类生命健康的头号因素，目前我国每年恶性肿瘤的发病、死亡和现患水平均居世界较高水平。因此，癌症的诊断成为保障人类健康最重要的环节之一。月中瘤远处转移是肿瘤患者死亡的主要原因。在原发上皮肿瘤形成和生长早期，一些具有高度活力和高度转移潜能的肿瘤细胞与肿瘤母体脱离，进入到人体外周血循环系统中成为循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTC)，并散播到远处器官。大量研宄表明，CTC不仅是肿瘤发生远处转移的必经步骤，也为肿瘤转移的鉴定提供关键线索。CTC的分析检测被认为是对肿瘤患者的实时“液体活检”。这种活检能对CTC特异性亚群进行表征，提供一些非常有价值的临床信息，例如早期CTC检测可提示及时开展抗转移治疗、追踪肿瘤复发，从而减缓甚至阻止癌症的致命攻击。CTC检测还可以为化疗药物的快速评估、肿瘤新药物的开发以及个体化治疗的药物筛选、耐药性分析等提供及时可靠的依据，从而为肿瘤的检测和控制带来革命性的转变。
[0003]目前，用于CTC检测的方法通常分为两大类:富集技术和检测技术。基于CTC的物理性质(大小、密度、电荷、变形性)和生物学性质(表面蛋白多数为EpCAM表达)，将它们和周围正常血细胞区分，达到富集的目的。而富集得到的CTC依然含有大量白细胞，进一步的鉴定则需要在单细胞水平上区分CTC和正常血细胞。常用的鉴定方法包括细胞角蛋白(cytokeratin, CK)的焚光染色(阳性标记)、白细胞共同抗原⑶45 (阴性标记)和一种核染料(DAPI)，被确定的CTC为CK+/CD45-/DAPI+细胞。
[0004]上述现有技术无法判断检测到的细胞是存活还是凋亡的。因为只有功能细胞才可以促成转移灶的形成。为了只对存活的CTC进行检测，EPISP0T技术(上皮免疫斑点法)得以运用，它可被添加到任意富集步骤中。这种技术可在分泌、脱落和释放蛋白质的48h短时培养中对CTC的存在进行评估。然而在实际操作中，由于外周血中CTC的浓度非常低(数百万正常造血细胞中仅有几个到几十个CTC)，现有技术在临床应用上鉴定灵敏度不高，针对性较低，缺乏敏感和特异的分析方法，很难得到理想的检测效果。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种循环肿瘤细胞检测探针及其制备方法以及应用诊断传感器，解决了现有技术中CTC细胞诊断检测的灵敏度不高，特异性不强的技术问题，达到了提升检测灵敏度和针对性的效果。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测探针，包括:由金/硅纳米粒子、酶标记物以及抗体复合构成酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物。
[0007]进一步地，所述酶标记物为辣根过氧化物酶，所述酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物为辣根过氧化物酶-金/硅纳米粒子-抗体复合物(HRP-Si/AuNPs-Ab(x))；
[0008]其中，X为大于O的自然数。
[0009]一种循环肿瘤细胞检测探针的制备方法，包括:
[0010]硅纳米粒子的制备；
[0011]金/硅纳米复合材料的制备；
[0012]酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物的制备；
[0013]其中，所述娃纳米粒子的制备步骤的终产物为所述金/娃纳米复合材料的制备步骤的原料，所述金/娃纳米复合材料的制备步骤的终产物为所述酶标记物-金/娃纳米粒子-抗体复合物的制备步骤的原料。
[0014]进一步地，所述娃纳米粒子的制备步骤:
[0015]依次将2.6mL乙醇、500 μ L蒸馏水和300 μ L氨水加入容器中混合搅拌；
[0016]再向容器中加入170 μ L正硅酸乙酯室温搅拌，得到混合液；
[0017]所述混合液离心后弃去上层清液，润洗下层固体，干燥后得到硅纳米粒子；
[0018]其中，所述乙醇、所述蒸馏水、所述氨水以及所述正硅酸乙酯可根据实际需求，在保持投入比例的情况下增减。
[0019]进一步地，所述金/娃纳米复合材料的制备步骤:
[0020]将8mg上述硅纳米粒子分散于ImL四氯金酸三水合物溶液中，用氢氧化钠将pH调至7-8，溶液呈粉红色；
[0021]再加入30 μ L盐酸氢胺，溶液由粉红色变成深棕色，得到混合液；
[0022]再将上述混合液置于恒温摇床上震荡，随后静置，去除上清液，将得到的纳米复合物重悬于水中再去除上清液，重复此步骤数次，得到的沉淀复合物分散在双蒸水中且储存备用;
[0023]其中，所述硅纳米粒子、所述四氯金酸三水合物溶液以及所述盐酸氢胺可根据实际需求，在保持投入比例的情况下增减。
[0024]进一步地，所述酶标记物-金/娃纳米粒子-抗体复合物的制备步骤:
[0025]将所述金/硅纳米复合物分散在羟基乙酸中并置于超声波设备中，进行超声混合，之后再用磷酸盐缓冲液反复润洗；
[0026]将上述润洗后的金/硅纳米复合物加入至ImL含有400mM可溶于水的碳二亚胺和10mM N-羟基琥珀酰亚胺的MES缓冲溶液(pH 5.2)中并置于超声波设备中，进行超声混合，所得混合溶液离心后弃去上层清液；
[0027]向离心后得到的沉淀中加入500 μ L ant1-CA153(400ng/mL)和500 μ LHRP (80 μ g/mL)，室温下搅拌4小时，并用磷酸盐缓冲溶液润洗数次；
[0028]将所得复合物分散在ImL含有3 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中，4°C储存备用；
[0029]其中，本步骤涉及的反应溶液投入量可根据实际需求，在保持投入比例的情况下增减。
[0030]一种采用循环肿瘤细胞检测探针的诊断传感器，包括:所述循环肿瘤细胞检测探针以及载物芯片；
[0031]所述载物芯片承载待检测样本。
[0032]进一步地，所述载物芯片上设置柱状凸起结构。
[0033]进一步地，所述载物芯片采用硅片，所述柱状凸起采用聚二甲基硅氧烷与交联剂的混合物；
[0034]其中，所述聚二甲基硅氧烷与交联剂的混合比例为10:1。
[0035]一种采用所述循环肿瘤细胞检测探针的诊断传感器进行诊断检测的方法，包括:
[0036]分别向多个所述诊断传感器滴加ant1-EpCAM抗体(10 μ g/mL)，然后在上述多个诊断传感器上分别加入不同浓度的待检样本，置于培养箱中培养；
[0037]用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，再向培养过后的上述多个诊断传感器中分别加入辣根过氧化物酶-金/硅纳米粒子-抗体复合物(HRP-Si/AuNPs-Ab(x))，反应一段时间后洗涤；
[0038]用微分脉冲伏安法进行电化学检测，在扫速为50mV/s，电位扫描范围0.5?-0.45V条件下检测金/娃纳米复合物(Si/AuNPs)的信号，测定样品中循环肿瘤细胞的含量。
[0039]进一步地，所述待检样本的细胞浓度量级范围是101，12, 13, 14, 15, 16, 17个/
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[0040]本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点:
[0041]1、本申请实施例中提供的循环肿瘤细胞检测探针，采用辣根过氧化物酶-金/硅纳米粒子-抗体复合物；由于金/硅纳米粒子良好的生物兼容性和较大的表面积，可以极大的提高信号物辣根过氧化物酶的固定量，因此该纳米放大技术有效的提高了电化学响应信号和针对性，从而便于电化学检测，实现高灵敏度检测。
[0042]2、本申请实施例中提供的采用循环肿瘤细胞检测探针的诊断传感器，由于采用3D芯片结构，导致细胞触角与柱状凸起之间具有较强的作用力，从而增大了细胞与芯片之间的相互作用，最终导致目标细胞捕获效率得以大幅提高，从而提升了检测的灵敏度，使得诊断检测的效率和可靠性大大提尚。
[0043]3、本申请实施例中提供的采用循环肿瘤细胞检测探针的诊断方法，建立了微分脉冲伏安法峰电流与目标细胞浓度之间的线性关系。峰电流与循环肿瘤细胞浓度呈良好的线性关系，循环肿瘤细胞的线性浓度范围为1H017ceIl mL—1，检出限为lOcells mL—1，大大优于现有技术的检测范围，大大提升了临床应用的效率，具备卓越的临床诊断意义。
【附图说明】
[0044]图1为本发明实施例提供的微分脉冲伏安法测定不同浓度循环肿瘤细胞的峰电流曲线和校正曲线。
【具体实施方式】
[0045]本发明实施例提供的一种循环肿瘤细胞检测探针，包括:由金/硅纳米粒子、酶标记物以及抗体复合构成酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物，用于诊断检测循环肿瘤细胞CTC。
[0046]本实施例提供的酶标记物采用辣根过氧化物酶，进一步地，酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物为辣根过氧化物酶-金/硅纳米粒子-抗体复合物(HRP-Si/AuNPs-Abw);其中，X为大于O的自然数。即，针对不同癌细胞，选用不同的抗体复合构成相应的复合物探针。如针乳腺癌循环肿瘤细胞MCF-7，采用Ab2。
[0047]本实施例还提供针对上述循环肿瘤细胞检测探针的制备方法，包括如下三个主要步骤，本别按照制备顺序，依次是:
[0048]硅纳米粒子的制备；
[0049]金/硅纳米复合材料的制备；
[0050]酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物的制备；
[0051]其中，娃纳米粒子的制备步骤的终产物:娃纳米粒子，为金/娃纳米复合材料的制备步骤的原料，金/娃纳米复合材料的制备步骤的终产物:金/娃纳米复合材料，为所述酶标记物-金/硅纳米粒子-抗体复合物的制备步骤的原料。
[0052]下面分别详述上面三个步骤的操作过程。其中，本实施例中涉及的用量仅仅是一种优选的数据组合，同比例增加或者减少也能达到效果。
[0053]娃纳米粒子的制备步骤:
[0054]依次将2.6mL乙醇、500 μ L蒸馏水和300 μ L氨水加入容器中混合搅拌；搅拌时间通常设定为5分钟。
[0055]再向容器中加入170 μ L正硅酸乙酯室温搅拌，搅拌8小时后得到混合液。
[0056]所述混合液离心后弃去上层清液，润洗下层固体，干燥后得到硅纳米粒子；通常在在15，OOOg条件下离心10分钟。
[0057]其中，乙醇、所述蒸馏水、所述氨水以及所述正硅酸乙酯可根据实际需求，在保持投入比例的情况下增减，以期获得不同的产量。
[0058]金/娃纳米复合材料的制备步骤:
[0059]将8mg上述步骤制备的硅纳米粒子分散于ImL四氯金酸三水合物溶液中，用氢氧化钠将PH调至7-8，溶液呈