盐酸克伦特罗的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种盐酸克伦特罗的快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 瘦肉精是具有肾上腺素受体激动作用的一类药物的统称，又称β 2-兴奋剂，具有 促进肌肉生长、提高瘦肉率的作用，曾作为生长添加剂被广泛关注，但β 2-受体激动剂在 动物体内有一定的残留时间，通过食物链进入人体后会使一些易感人群产生明显的中毒症 状，危害人类健康。盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB)是瘦肉精中的一种，它能够明显促 进动物生长，并增加瘦肉率，因而被一些不法分子使用在动物生产中用来增加瘦肉率。研宄 表明，残留在动物体内的盐酸克伦特罗被人使用后会毒害肾脏、肝脏等器官，会出现头痛不 适、恶心呕吐、肌肉颤抖、心率加快、头晕目眩等症状，甚至会导致死亡，因此，我国严禁在动 物生产中使用盐酸克伦特罗。现有检测盐酸克伦特罗的方法均需要复杂的样品处理过程和 分析步骤，需要大型仪器及经过专门训练的专业人员操作，时间长、成本高，远不能满足在 线检测的要求。
[0003] 试纸法由于具有携带方便、操作简单、测定速度快等特点，在食品、水质、医疗卫生 等领域有较多应用。如2001年河南省农科院动物免疫学重点实验室与河南百奥生物工程 有限公司于成功研发了"瘦肉精"专用快速检测试纸技术并投放市场，使用该试纸可在60 秒内快速直观地检测出肉品中是否含有超过安全标准的"瘦肉精"，该试纸检测技术以单克 隆抗体为基础设计而成，检测时胶体金标记的"瘦肉精"单抗被检测线上固定化的"瘦肉精" 人工结合抗原捕获，形成一条棕红色的检测线，过量的胶体金标记单抗继续涌动被对照线 上固定化的羊抗鼠抗体捕获形成一条棕红色的对照线，如果样品中含有"瘦肉精"，它将与 固定化在检测线上的人工抗原竞争有限的胶体金标记单抗。申请号为200810219632. 1的 中国专利，公开了一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法，该纸包括支撑固定粘衬层，在 支撑固定粘衬层上依次有样品吸附层、结合垫、微孔虹吸反应层和吸水材料层，在结合垫上 有示踪粒子标记的盐酸克伦特罗抗体和示踪粒子标记的抗体A，当样品中含有5纳克以上 的盐酸克伦特罗时，检测区出现两条线，当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，检测区 出现一条线，该试纸具有与夹心法等同的检测模式及判读方式且成本低，该检测方法简便 快捷，操作简单。但上述方法在使用中存在以下问题：超过判读时间容易出现假阴性、假阳 性结果，质控线有时不显现，检测线颜色模糊不清，漏检率偏高等，因此，寻找一种快捷、方 便、高选择、高灵敏的检测盐酸克伦特罗的试纸方法具有重要意义。
[0004] 分子印迹是近年来兴起的分子特异性识别技术，具有对模板分子在功能基团、分 子尺寸、空间结构具有记忆功能的结合位点，可以根据预定的选择性和高度识别性能进行 分子识别，在印迹中形成的特异性识别位点能和被分析物选择性作用，并且这种作用是可 逆的，这种合成的材料机械强度和化学稳定性好，能在极端环境中使用。现已有将分子印迹 技术结合试纸法制备得到的分子印迹试纸条，不仅具备了分子印迹特异识别能力，且具有 试纸条检测速度快、携带方便的特点，但是目前尚未采用分子印迹试纸条检测盐酸克伦特 罗的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有的经典盐酸克伦特罗的检测方法前处理复杂、时间长、成本高，现 有的试纸法易出现假阴性假阳性结果、漏检率高等现状，提供了一种盐酸克伦特罗的快速 检测方法，该方法简单、快速、成本低。本发明可用于待测样品中盐酸克伦特罗的在线痕量 检测。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] 一种盐酸克伦特罗的快速检测方法，该方法包括以下步骤：
[0008] 1.取盐酸克伦特罗分子印迹试纸条，在其反应区内滴加30 μ L活性为200-400ug/ mL的葡萄糖氧化酶标记盐酸克伦特罗溶液，孵化反应5-10分钟，40°C烘干后，用70 μ L水淋 洗反应区；
[0009] 2.在淋洗过的反应区内滴加25 μ L待测样品溶液，竞争反应8-12分钟，用70 μ L 水淋洗反应区；
[0010] 3.在淋洗过的反应区内滴加20 μ L 0. lg/mL葡萄糖溶液，再滴加20 μ L 8 X 10_5mol/L署红Y溶液，酶催化反应3-7分钟，将试纸条在40°C烘干；
[0011] 4.取荧光比色皿，将步骤3得到的干燥试纸条贴在比色皿透光一侧，将比色皿置 于荧光分光光度计中，设定以下检测条件：激发波长为500nm，狭缝宽度EX = 3. Onm，EM = 3. Onm，对试纸条荧光强度进行检测，即得。
[0012] 以上所述盐酸克伦特罗的快速检测方法，所述待测样品溶液的制备方法为：称取 待测样品，加入20mL lmol/L盐酸溶解，再加入180mL水，避光震荡20-30分钟，以3000r/ min的速率离心20-30分钟，取上清液，用lmol/L NaOH溶液调节溶液pH值为7. 5-8. 5,即 得。
[0013] 以上所述盐酸克伦特罗的快速检测方法，所述分子印迹试纸条，包括基底和反应 区，所述反应区为覆盖基底镂空区域的对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素 膜；
[0014] 所述对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜的制备方法为：将硝酸 纤维素膜放入盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液中浸泡30分钟，取出后置40°C烘箱内烘 干，用15-40 %乙醇洗涤硝酸纤维素膜，再用水洗涤硝酸纤维素膜，晾干，即得；
[0015] 所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液是以盐酸克伦特罗为模板分子，以α -甲 基丙烯酸为功能单体，以氢键形式进行相互作用，加入交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺、弓丨 发剂过硫酸铵发生自由基共聚，得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液；所述模板分子、功 能单体、交联剂的摩尔比为117-274:1-300:30-90。
[0016] 以上所述分子印迹试纸条，所述反应区可位于基底的任一位置，为方便操作，优选 位于基底的一端。
[0017] 以上所述分子印迹试纸条，所述基底的材料可为不影响试验的任何材料，优选为 塑料或相片纸。
[0018] 一种以上所述的分子印迹试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 1.盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液的制备：
[0020] a.配制浓度为3 X 10_3-3 X 10_5mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；
[0021] 匕将3-7 4 1^-甲基丙烯酸加入到10-3011^浓度为3\10_3-3\10_5111〇1/1盐酸克 伦特罗水溶液中，超声处理5-15分钟，再加入0. 0014-0. 0042g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继 续超声处理10-30分钟，静置过夜，得混合液；
[0022] c.将80-120 μ L浓度为0. 5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤b得到的混合 液中，超声处理10-20分钟，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。
[0023] 2.对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素 膜放入盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液中浸泡30分钟，取出后置40°C烘箱内烘干，用 15-40%乙醇洗涤硝酸纤维素膜，再用水洗涤硝酸纤维素膜，晾干，剪裁好；
[0024] 3.剪裁基底，在基底内剪裁出一镂空区域，在镂空区域的基底周围涂上胶水或粘 上双面胶，将上述步骤2中剪裁好的对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜 粘在基底上，再盖压一个具有相同镂空区域的基底，即得。
[0025] 以上所述分子印迹试纸条的制备方法，所述步骤3中基底的大小优选为 8cmX lcm，所述镂空区域的大小优选为4cmX0. 8cm。
[0026] 以上所述的分子印迹试纸条的应用，用于待测样品中盐酸克伦特罗的定性、半定 量或定量检测。所述待测样品可为任何可能含有盐酸克伦特罗物质，如饲料、尿液等，通过 酸、碱或酶解等方法进行预处理，制备成待测样品溶液。
[0027] 以上所述盐酸克伦特罗的快速检测方法，所述活性为200_400ug/mL的葡萄糖氧 化酶标记盐酸克伦特罗溶液采用高碘酸氧化法制备，其制备方法为：称取5. Omg葡萄糖氧 化酶溶解于ImL水中，加入0. 1~0. 3mL新配的0. lmol/L NaIO4溶液，室温下避光搅拌10~ 30分钟；将搅拌好的溶液装入MW4000透析袋中，对lmmol/L pH值为4. 4的HAc-NaAc缓冲 液透析，4°C过夜；取上清液，加入10~40 μ L 0. 2mol/L pH值为9. 5的碳酸盐缓冲液，使葡 萄糖氧化酶的pH值升高至9. 0~10. 0,得葡萄糖氧化酶溶液；取IOmL比色管，加入7mg盐 酸克伦特罗及1~3mL 0.0 lmol/L pH值为9. 5的碳酸盐缓冲液，待其完全溶解后，加入上述 葡萄糖氧化酶溶液，混匀，室温避光搅拌1~3h，再加入0.1 mL新配的4mg/mL NaBH4溶液，混 匀，在4°C的环境中放置1~3h，得混合溶液；将所得混合溶液装入透析袋中，对0. 15mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析，4°C过夜；透析完成后，将透析袋内的溶液取出，并于4°C 避光保存，即得葡萄糖氧化酶标记盐酸克伦特罗溶液，酶标仪测定其浓度为200~400ug/ mL〇
[0028] 本发明按照外标法以荧光显色强度计算待测样品中盐酸克伦特罗的含量，计算公 式为：
[0029] Δ If= 218. 030-28. 65 (-IgC)
[0030] Λ If为空白荧光值与待测样品荧光值的差值，
[0031] C为待测样品溶液的浓度。
[0032] 本发明利用化学法聚合得到盐酸克伦特罗的分子印迹聚合物，制备成对盐酸克伦 特罗具有特异性识别能力的分子印迹试纸条，试纸条反应区表面的孔穴能够同时识别盐酸 克伦特罗及具有相同结构的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗。将洗脱模板分子的试纸条 在高浓度的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗中孵化后，印迹孔穴被葡萄糖氧化酶标记的 盐酸克伦特罗占据。随后竞争反应是在样品中的盐酸克伦特罗和印迹膜上的葡萄糖氧化酶 标记的盐酸克伦特罗之间进行，盐酸克伦特罗能够竞争取代葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦 特罗重新占据孔穴。随着样品中盐酸克伦特罗分子浓度的增加，印迹膜上被竞争取代的葡 萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗就越多，即残留在印迹膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印 迹膜表面的葡萄糖氧化酶能够与底液中的葡萄糖发生酶解反应产生过氧化氢，过氧化氢进 一步氧化分解底液中的署红Y使其褪色，因此，通过荧光分光光度计检测试纸条的荧光强 度，能对样品中的盐酸克伦特罗进行快速定量分析。
[0033] 本发明的有益效果是：
[0034] 1.本发明利用分子印迹试纸条及荧光分光光度法来检测盐酸克伦特罗，克服了现 有的盐酸克伦特罗检测方法前处理复杂、时间长、成本高等现状，该方法具有简单、快速、成 本低、准确可靠等优点，可用于