一种免疫磁珠及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫磁珠技术领域，尤其涉及一种表面基团为羧基的免疫磁珠及其制 备方法和其在食源性致病菌检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 食源性致病菌检测免疫磁珠制备技术是将检测用抗体分子固定在磁性粒子表面， 在外加磁场作用下，利用特异性识别结合作用将免疫磁珠以及捕获到的致病菌富集分离的 技术。这一检测方法灵敏度高，且具有操作简单便捷的优势。
[0003] 在食源性致病菌检测分离用免疫磁珠中，采用羧基固定抗体分子的免疫磁珠应用 较广。这类免疫磁珠多是将羧基材料(如聚丙烯酸）包裹在磁珠表面，利用免疫磁珠表面 存在的大量自由羧基与多肽或者抗体结构中氨基反应，将抗体或者多肽固定在免疫磁珠表 面。这种免疫磁珠表面大量自由羧基的存在利于提高抗体固定效率。但是也存在弊端，由 于电荷屏蔽作用降低了粒子间斥力，单纯的聚丙烯酸包被的免疫磁珠在检测液体中粒度稳 定性下降，易于发生粒子间团聚导致沉淀失去检测能力。
[0004] 为保证上述免疫磁珠粒度稳定性，免疫磁珠的表面自由羧基量受到一定限制。然 而，羧基数量以及由之决定的抗体分子的固定量直接决定免疫分离识别效率。因此，在基于 羧基磁珠的分离体系中，设法平衡磁珠粒度稳定性以及羧基数量相关的免疫分离效果极为 重要。寻求一种制备简单的表面富含羧基并能维持检测缓冲液环境下粒度稳定性的羧基化 磁珠成为目前免疫磁珠研究领域面临的难题之一。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种免疫磁珠及其制备方法和应用，所述免疫 磁珠为羧基磁珠，其表面富含羧基，抗体固定效率高；并且所述免疫磁珠在检测缓冲液环境 下粒度稳定性高。
[0006] 在第一方面，本发明提供一种免疫磁珠，包括磁性粒子内核和包被在所述磁性粒 子内核外表面的羧基糖类，其中所述磁性粒子包括超顺磁性四氧化三铁。
[0007] 本发明的免疫磁珠中，超顺磁性四氧化三铁为免疫磁珠提供磁分离所需要的磁 性，除此之外还可能在不影响磁性的情况下包含三氧化二铁或杂质成分。
[0008] 本发明的免疫磁珠中，羧基糖类分子中众多羟基的水合性能保证磁珠的水力学尺 寸稳定性，能够长期稳定地分散在电解质溶液中，而不发生沉淀或团聚现象，例如本发明的 尺寸为30nm的羧基葡聚糖免疫磁珠在磷酸缓冲液中能够维持长期（24小时以上)稳定而不 沉淀，而相同条件下尺寸相当的聚丙烯酸免疫磁珠在磷酸缓冲液中静置2小时就会完全沉 淀至容器底部；同时糖类分子中部分羟基转化为羧基，利于抗体或多肽的高效固定。
[0009] 本发明的免疫磁珠中，糖类的作用在于一方面提供大量的羟基，其水合性能保证 磁珠的水力学尺寸稳定性；另一方面部分羟基转化为羧基提供抗体或多肽固定所需要的位 点。因此本发明中糖类的具体种类可以不做限定，只要具有大量羟基，并且部分羟基能够转 化为羧基即可。
[0010] 作为本发明的优选技术方案，所述糖类选自葡萄糖、果糖、葡聚糖、蔗糖和麦芽糖 中的1种或至少2种的组合，所述组合典型并非限定性的实例比如葡萄糖和果糖的组合，葡 萄糖和葡聚糖的组合，葡萄糖和蔗糖的组合，果糖和葡聚糖的组合，果糖和蔗糖的组合，果 糖和麦芽糖的组合，蔗糖和麦芽糖的组合，葡萄糖、果糖和葡聚糖的组合，果糖、葡聚糖和蔗 糖的组合，葡聚糖、蔗糖和麦芽糖的组合，等等；优选葡萄糖、果糖和葡聚糖中的1种或至少 2种的组合。
[0011] 作为本发明的优选技术方案，所述免疫磁珠的粒径介于20nm-3 μ m范围内，例 如 30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、500nm、700nm、900nm、1. 2 μ m、1. 5 μ m、1. 8 μ m、2. 1 μ m、 2· 4 μ m、2. 7 μ m、2. 8 μ m、2. 9 μ m、50nm-800nm或 200nm_l· 5 μ m，优选 lOOnm-l μ m范围内。免 疫磁珠的粒径过大会造成沉淀或团聚现象的发生，分散性能差；免疫磁珠的粒径过小往往 导致与抗体或多肽结合的困难，可能由于空间位阻效应。
[0012] 在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的免疫磁珠的方法，包括如下步 骤：
[0013] (1)磁珠的制备：使三价铁源、二价铁源和糖类在碱性溶液作用下共沉淀生成包含 顺磁性四氧化三铁的磁性粒子，所述磁性粒子表面包被有糖类分子；
[0014] (2)磁珠的羧基化：用多元酸酐与磁性粒子表面的糖类分子反应生成羧基糖类包 被的免疫磁珠。
[0015] 作为本发明的优选技术方案，所述三价铁源与糖类的质量比为0. 1:1~6:1，例如 0· 1:1、0· 2:1、0· 5:1、0· 8:1、1:1、1· 2:1、1· 5:1、2:1、3:1、4:1、5:1 或 5. 8:1，优选为 1:1 ~ 4:1。如果三价铁源过多，会导致形成的磁性粒子不能被糖类充分包被，在免疫反应过程中 可能会有不希望发生的非特异性结合；如果糖类过多可能会影响共沉淀反应的发生，导致 不能形成良好的磁性粒子，并且也是不必要的浪费。
[0016] 作为本发明的优选技术方案，所述磁珠的制备在温度为60~95°C下进行，例如 在温度为 62°〇、641：、671：、691：、711：、751：、781：、821：、881：、921：或941：下进行，优选为 80~90°C下进行。
[0017] 作为本发明的优选技术方案，所述共沉淀的反应时间为15分钟~1小时，例如16 分钟、18分钟、20分钟、25分钟、28分钟、32分钟、36分钟、40分钟、45分钟、48分钟、52分 钟、55分钟或58分钟，优选为30分钟~45分钟。
[0018] 作为本发明的优选技术方案，所述共沉淀反应在惰性气体保护下进行，所述惰性 气体包括但不限于氮气、氦气、氖气和氩气中的1种或至少2种的组合。
[0019] 本发明中，所述三价铁源的作用在于提供反应所需要的三价铁离子，因此对于三 价铁源的种类不做限定，可以是任何能够提供三价铁离子的含铁化合物。作为本发明的优 选技术方案，所述三价铁源选自氯化铁、硝酸铁和硫酸铁中的1种或至少2种的组合；所述 组合典型并非限定性的实例比如氯化铁和硝酸铁的组合，氯化铁和硫酸铁的组合，硝酸铁 和硫酸铁的组合，氯化铁、硝酸铁和硫酸铁的组合。
[0020] 本发明中，所述二价铁源的作用在于提供反应所需要的亚铁离子，因此对于二价 铁源的种类不做限定，可以是任何能够提供亚铁离子的含铁化合物。作为本发明的优选技 术方案，所述二价铁源选自氯化亚铁、硝酸亚铁和硫酸亚铁中的1种或至少2种的组合；所 述组合典型并非限定性的实例比如氯化亚铁和硝酸亚铁的组合，氯化亚铁和硫酸的组合， 硝酸亚铁和硫酸的组合，氯化亚铁、硝酸亚铁和硫酸的组合。
[0021] 作为本发明的优选技术方案，所述糖类选自葡萄糖、果糖、葡聚糖、蔗糖和麦芽糖 中的1种或至少2种的组合，所述组合典型并非限定性的实例比如葡萄糖和果糖的组合，葡 萄糖和葡聚糖的组合，葡萄糖和蔗糖的组合，果糖和葡聚糖的组合，果糖和蔗糖的组合，果 糖和麦芽糖的组合，蔗糖和麦芽糖的组合，葡萄糖、果糖和葡聚糖的组合，果糖、葡聚糖和蔗 糖的组合，葡聚糖、蔗糖和麦芽糖的组合，等等；优选葡萄糖、果糖和葡聚糖中的1种或至少 2种的组合。
[0022] 本发明中，所述碱性溶液的作用在于为共沉淀反应提供碱性环境，因此对于碱性 溶液的具体选择可以不做限定。作为本发明的优选技术方案，所述碱性溶液选自氨水、氢氧 化钠和氢氧化钾溶液中的1种或至少2种的组合；所述组合典型并非限定性的实例比如氨 水和氢氧化钾溶液