一种检测h3n2亚型犬流感病毒的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学技术领域，更具体地，设及一种检测H3N2亚型犬流感病毒的试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 犬流感（Canineinfluenza,CI)是由正粘病毒科A型流感病毒（IAV)属犬流感病 毒（CIV)引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病。该病首次于2004年在美国爆发，随后 在欧亚大陆等地区相继报道。CI主要分为册N2和册N8两种亚型，欧美W册N8亚型为主， 大部分亚洲国家WH3N2亚型为主。近十多年来，IAV不断突破种间束缚，在人和动物中交 叉感染，引起了人们对流感的普遍关注。
[0003] 犬是与人类接触最为亲密的动物之一，可能在流感传染过程中扮演着重要角色。 因此，需要加强对CI的研究；申请号为201410535918.6的中国专利公开了针对H3N2亚型 犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，它是W犬流感病毒分离株JS/10进行杂交瘤获得，现有 技术对于H3N2犬流感病毒的研究较少，不利于临床研究与发展。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术所存在的上述缺陷，提供一种检测 H3N2亚型犬流感病毒的试剂盒。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的：
[0006] -种检测H3N2亚型犬流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含杂交瘤细胞株 H3N2-CIV-HA-2巧产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典 型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCC201555,保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
[0007] 上述杂交瘤细胞株的制备方法；取血清效价符合融合要求的BALB/c小鼠脾细胞 与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG-1000进行融合；用HAT培养基筛选融合细胞， 用纯化后的H3N2CIV包被酶标板，采用间接化ISA方法筛选目的融合细胞；采用有限稀释 法，经3次亚克隆，最后获得稳定分泌犬流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0008] 由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体；所述单克隆抗体为IgG2a亚型，轻 链为Kappa链。
[0009] 所述单克隆抗体的制备方法：应用保藏编号为CCTCCC201555的杂交瘤细胞株， W1X1〇7只的量注入经FICA处理的8~10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察小鼠 腹部膨大时抽取腹水。采用琼脂糖亲和介质（ProteinA)纯化腹水获得。
[0010] 优选地，所述试剂盒还包括适于上述单克隆抗体和册N2亚型犬流感病毒发生抗 原抗体反应的检测试剂。
[0011] 优选地，上述试剂盒为化ISA试剂盒，包括包被有册N2亚型犬流感病毒的单克隆 抗体的固相载体、鸡源或兔源的H3N2亚型犬流感病毒的多克隆抗体、酶标抗体；所述H3N2 亚型犬流感病毒的单克隆抗体由交瘤细胞株册N2-CIV-HA-2巧产生，所述杂交瘤细胞株于 2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCC201555。
[0012] 更进一步地，所述试剂盒还包括封闭液、洗漆液、显色液、终止液、阳性和阴性对 照。
[0013] 本发明所述试剂盒中，可W用除了鼠源和犬源之外的其他多克隆抗体，具体地，可 W用兔源或鸡源的多克隆抗体。
[0014] 优选地，当选择用兔源多抗时，所述兔源的H3N2亚型犬流感病毒的多克隆抗体的 制备过程如下：用纯化的册N2亚型犬流感病毒免疫兔，背部皮下分多点注射，分别在0, 2,4 周共免疫S次，首次免疫为1. 5mg/只，二免和S免为2mg/只，S免后采集血液，分离血清纯 化后获得分离血清纯化得到。
[0015] 当选用鸡源多抗时，其制备过程如下；用纯化的H3N2亚型犬流感病毒免疫SPF成 年鸡，胸肌内分点注射，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化1-1. 5mg/羽，W后加强免疫时，用弗 氏不完全佐剂乳化，每次1. 5-2mg/羽。每次免疫间隔两周，S免后即可采集血液分离血清。
[0016] 优选地，所述酶标抗体为Goatanti-RabbitIgG(H&L)-HRP。所述阳性对照为册N2 CIV尿囊液，阴性对照为SPF阴性鸡胚尿囊液。
[0017] 具体地，阳性对照为用PBST稀释128倍的册N2CIV尿囊液（血凝效价为28);阴 性对照为用PBST稀释128倍的SPF阴性鸡胚尿囊液。
[0018] 更优选地，发明人通过方阵实验优化出ELISA试剂盒的最优配方；所述册N2亚型 犬流感病毒的单克隆抗体的包被浓度为0. 25yg/mL;兔源的H3N2亚型犬流感病毒的多克 隆抗体浓度为2. 5yg/mL;Goatanti-R油bitIgG(H&L)-HRP稀释度为1 ;10000;封闭液浓 度为5%。
[0019] 还提供上述任意一种试剂盒在检测犬流感病毒中的应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0021] 本发明提供了一种检测H3N2亚型犬流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含杂交瘤 细胞株册N2-CIV-HA-2巧产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏 在中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCC201555;用该试剂盒进行检测，灵敏度高， 特异性强，重复性和稳定性都很好，检测临床样本，检出率为大大高于常规检测，具有实际 的临床应用意义。
【附图说明】
[0022] 图1为册N2CIV浓缩纯化结果图。
[0023] 图2为杂交瘤细胞第7d生长状态图。
[0024] 图3为小鼠腹水与兔血清纯化效果图；M;蛋白质分子量标准；A;纯化后的兔血清 效果图；B;纯化后小鼠腹水。
[00巧]图4为单克隆抗体亚型鉴定结果；a;2巧分泌的McAb亚型检测结果；b;试纸条标 准显色条带说明。
[0026] 图5为单克隆抗体间接免疫巧光鉴定结果；a;册N2CIV感染的MDCK细胞；b;阴性 对照。
[0027] 图6为单克隆抗体WB试验鉴定结果；a;真核表达的册N2CIVNP、HA、PB1、PB2、 PA鉴定结果；b;真核表达的册N2CIVNS2、M2、Ml、NA鉴定结果；M;蛋白质分子量标准；C; 未转染质粒的正常293T细胞对照组。
[0028] 图7为阴性鸡胚尿囊液正态分布图。
[0029] 图8为双抗夹屯、ELISA敏感性试验。
[0030] 图9为双抗夹屯、ELISA特异性试验。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0032] 实施例1杂交瘤细胞株的制备
[0033] 一、H3N2亚型犬流感病毒的抗原制备
[0034]本发明所用的毒株A/canine/Guangdong/1/2006化3N2)(简称CGD1)，其Genbank 的登陆号为GU433345. UGU433346. UGU433347. UGU433348. UGU433349. UGU433350. 1、 GU433351. 1、GU433352. 1，毒株及其序列参照网址；http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ nuccore/ ? term = A% 2Fcanine% 2FGuangdong% 2F1% 2F2006% 28册N2% 29。
[00巧]1、病毒扩大培养：将稀释后的CGDl毒株鸡胚尿囊液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔， 接种量为0. 15血/胚，37°C解育。每1化观察一次，弃2化内死亡鸡胚，将2化后的死胚置 于4°C冰箱保存。9化后将所有鸡胚于4°C冷却过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，10, 00化/min,离 屯、lOmin，去沉淀留上清。参照国标方法佑B/T14926. 53-2001)，取少量尿囊液上清测定血 凝单位（HAU)，其余尿囊液上清于4°C暂存备用。
[0036] 2、病毒的灭活；在册N2CIV尿囊液上清中加入体积分数约0.1%的甲醒溶液，充 分混匀，4°C灭活3d，每隔Id充分振荡1次。测定灭活病毒液的HAU，尿囊液置4°C保存。
[0037] 3、病毒的纯化；a.将灭活的病毒液转入超离屯、管（超离屯、管内不能有气泡，应完 全装满，W免离屯、过程中爆管），3, 5000r/min离屯、比；b.及时弃上清，抽干离屯、管底部残留 上清。用已高压的2mLPBS重悬病毒沉淀，将重悬液转移至新EP管中备用；C.把不同浓度 的庶糖加入密度梯度离屯、管（总体积12mL)中，先加15%庶糖溶液2mU再顺序加入30%、 45%庶糖溶液各4mU每次加庶糖溶液时应将针头完全置于管底，用较高浓度庶糖溶液将较 低浓度庶糖溶液抬升。把步骤b的重悬病毒液1血加至庶糖溶液最上层，35, 0(K)r/min下离 屯、化；d.在光线明亮处，小屯、吸取各浓度庶糖层面交界处纯化产物，分别置于不同超离屯、 管中，加满PBS，35,000r/min下离屯、化，去庶糖；e.弃上清，加入PBS重悬沉淀，各管重悬 液吸出后分别转移至新高压EP管中，通过HA试验确定病毒粒子的分布。用分光光度计测 定纯化病毒化3N2CIV)蛋白浓度后，-20°C保存备用。
[003引实验结果：共收集到鸡胚尿囊液约600血，HAU为28,0. 1 %甲醒灭活后HAU下降一 个单位，为27。H3N2CIV主要存在于30%与45%庶糖